姜昱竹，胡雪梅，邢建琴，王跃嗣，刘现兵，郭春凤

(1滨州医学院烟台校区，山东烟台264003;2威海市文登中心医院)

原发性免疫缺陷病(PIDD)是由于免疫系统遗传基因异常或先天性免疫系统发育障碍而致免疫功能不全引起的罕见疾病，多发生于婴幼儿。患儿除表现为免疫功能缺损外，尚可伴有其他组织器官的发育不全或畸形，可导致患儿夭折［1］。近年研究表明，PIDD多数具有明显的遗传倾向［2］。2011年3月，我们采用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)转化PIDD患者外周血B淋巴细胞建立B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell line，B-LCL)，旨在为进一步开展PIDD的遗传学和分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 B95-8细胞株(本实验室保存)，RPMI1640培养基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，环孢菌素 A(Cyclosporin A，CsA，Sigma公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(天津TBD生物技术有限公司)，PIDD患者外周血(滨州医学院附属医院)。

1.2 实验方法

1.2.1 EBV悬液的制备 将B95-8细胞密度调整为1×106/mL，接种于10 mL含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d半量换液1次，逐渐增加培养基到所需体积，之后不再更换和补充培养基，至培养物变为黄色。收集细胞悬液于－70℃及37℃反复冻融3次，2 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，分装后－70℃保存备用。

1.2.2 外周血单个核细胞(PBMCs)分离 无菌采集PIDD患者外周肝素抗凝血6 mL，PBS等量稀释后沿管壁缓慢加于8 mL淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心15 min，小心吸出含有PBMCs的中间层将其转移至另一离心管中，PBS洗涤2次，收集细胞备用。

1.2.3 EBV转化B-LCL的建立 用3 mL含20%胎牛血清的完全RPMI1640培养基重悬上述PBMCs，加入EBV悬液1 mL，CsA 80μL(终质量浓度为2μg/mL)，混匀后转入T25培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。7 d左右镜下观察，根据细胞转化和增殖情况半量换液;待细胞较多聚团生长时传代至T75培养瓶中，继续培养、换液和传代;3～4周可获得稳定的B-LCL。

1.2.4 B-LCL的冻存与复苏 预先配制细胞冻存液(95%胎牛血清+5%二甲基亚砜)，按每管5×106个细胞加入1.5 mL冻存液，放入预冷的梯度降温细胞冻存盒中，－80℃过夜，次日移入液氮中长期保存。复苏时将细胞冻存管迅速置于37℃水浴箱融化，离心去上清，以含20%胎牛血清的完全RPMI1640培养基重悬细胞后移入培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.5 B-LCL的核型检测 取 PBMCs和转化后细胞B-LCL分别加新鲜培养液培养18～24 h，充分吹散细胞团，加秋水仙素37℃放置2 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清;以KCl溶液(0.075 mol/L)8 mL重悬沉淀，37℃放置30 min;加入甲醇/冰醋酸1 mL，轻轻吹打混匀，离心弃上清;加入甲醇/冰醋酸10 mL轻轻重悬沉淀，室温放置30 min，离心弃上清;重复甲醇/冰醋酸固定2次，离心后剩余1 mL液体重悬沉淀;常规法制片;晾干后Giemsa染色观察。

2 结果

2.1 B-LCL的形态学特征 接种后7 d左右倒置显微镜显示，细胞形态呈淋巴母细胞样改变，细胞体积明显增大，呈圆形或椭圆形，胞质丰富(图1A);约2周开始形成肉眼可见、大小不等的白色细胞克隆(图1B);之后随细胞分裂增生，细胞数量不断增多，细胞克隆不断增大，呈悬浮或半贴壁生长(图1C)，高倍镜下可见细胞克隆边缘有毛刺状突起。

图 1 EBV 转化 7 d(A)、14 d(B)、21 d(C)B淋巴母细胞的形态(100×)

2.2 B-LCL的冻存、复苏与扩增 细胞在液氮中保存4周后复苏活性良好，台盼蓝染色显示细胞活性＞90%。复苏后3 d即可传代，镜下观察细胞形态正常。建立的B-LCL细胞系可连续传代培养4个月以上。

2.3 B-LCL的核型 PBMCs和转化后细胞B-LCL染色体的核型分析未见异常。

3 讨论

自1952年Bruton发现首例PIDD以来，迄今为止已发现160多种PIDD［3］。PIDD发病年龄早，临床以感染为主要特征，可严重影响患儿的生活质量，并造成高致残率和高致死率［1］。尽管其病因尚未完全清楚，但目前已发现百余种与PIDD相关的基因异常［2］。外周血淋巴细胞是细胞遗传学和分子遗传学研究最常用的标本，然而其寿命有限，给进一步的研究工作带来许多不便。EBV是一种普遍存在的人类疱疹病毒，在体外能够高效率感染静止的B淋巴细胞，使其成为连续分裂、永久生存的BLCL，是在体外获得无限量B淋巴细胞及保存遗传信息的有效手段［4］。EBV基因组可以500～800拷贝存在于宿主细胞中，对其基因组 DNA多无影响［5］。因此，永生化B-LCL可保存提供血样个体的完整基因组，且其生化和分子生物学特性不发生变化［6］。此外，EBV在体外对B淋巴细胞的转化效率很高，一般能达到80% ～100%。近年来，国内外实验室普遍采用EBV感染外周血来建立人类遗传种质库。目前为止，本实验室共建成PIDD患者外周血永生化 B-LCL细胞株 16例，建株成功率为100%。

正常人群中约90%以上个体在儿童时期曾感染过EBV，其形成的抗EBV免疫功能可持续终身。体外建系时，EBV特异性的记忆T淋巴细胞接触病毒后可被激活，对EBV转化的B淋巴细胞产生特异的细胞毒作用［7］，使得形成的淋巴母细胞克隆很快退化;另外CD+4T淋巴细胞也可通过CD95和CD95配体介导转化B淋巴母细胞的凋亡［8］，使B淋巴细胞不能转化或其转化的增殖灶在1～2周迅速退化，致使建系失败。因此，抑制或去除外周血中T淋巴细胞的活性是建立B-LCL的关键。CsA是一种高效免疫抑制剂，能够在G0、G1期选择性抑制T淋巴细胞RNA聚合酶Ⅱ的活性［9］，使T淋巴细胞失去对EBV的免疫反应，从而有效防止已转化的B淋巴母细胞退化，使B-LCL的建系和增殖得以成功。本实验即采用EBV感染加CsA转化的方法建系，结果显示转化后细胞的体积明显增大，呈母细胞化，聚集成团，悬浮或半贴壁生长;能够成功冻存、复苏及传代;且转化后细胞的染色体核型与PBMCs比较无明显差异。表明PIDD患者永生化的B-LCL成功建立，且转化后细胞核型稳定，保留了原有的遗传标志。

综上所述，本实验成功建立了PIDD患者永生化的B-LCL，为进一步开展PIDD的病因学研究及诊断、治疗奠定了基础。

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