李念文，周文献，廖小莉，林 燕，李永强

(1扶绥县人民医院，广西扶绥532100;2广西医科大学附属肿瘤医院)

据报道，脑肿瘤约占所有儿童肿瘤的20%［1］，为发病率最高的儿童实体肿瘤。胶质瘤约占儿童脑肿瘤的10%［2］，可发生于中枢神经系统的任何位置。迄今为止，某些类型的神经胶质瘤(如弥漫性脑干胶质瘤)仍然是儿童颅内肿瘤死亡的主要原因之一［1］，该分型胶质瘤儿童的中位生存时间不超过1 a［2］。胶质瘤具有遗传性疾病的特征，即同时存在基因表达缺陷与过度表达［3］。富含半胱氨酸酸性蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)已经被证实在胶质瘤中表达增强并促进了其发展进程［4］。2011年10月 ～2012年3月，我们通过RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)下调胶质瘤细胞株SPARC表达，并观察了后者对胶质瘤细胞增殖、迁徙及黏附能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 ①细胞及其培养所用材料:人胶质瘤细胞系U251(中南大学湘雅中心实验室提供)，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养;胎牛血清，DMEM培养基，PBS及HBSS缓冲液，胰蛋白酶(美国Introvigen公司);细胞培养液由10%胎牛血清加入DMEM培养基中制备而成，每毫升培养液含青霉素100 U及链霉素0.1 mg;将0.25%胰蛋白酶溶于HBSS缓冲液后过滤除菌，用于细胞消化传代。②RNA干扰试验相关材料:小干扰RNA(siRNA)试剂均为北京傲锐东源(OriGene)公司产品，包括预设计人双链siRNA片段(Human-3 unique 27mer siRNA duplexes)，空白对照人双链siRNA阴性对照片段(Trilencer-27 Universal Scrambled Negative Control siRNA Duplex)及溶解siRNA的去RNA酶缓冲液(RNAse free siRNA Duplex Resuspension Buffer)，RT-PCR实验用TRIzol与逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，TaKaRa Ex Taq耐热性DNA聚合酶及引物由上海生工生物工程公司提供。③细胞增殖、迁徙及黏附实验相关材料:噻唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品，溶于PBS缓冲液(终质量浓度为5 mg/mL)，用0.22μm滤膜过滤除菌后4℃避光保存;嵌入式细胞培养室 Boyden Chamber购于美国Becton Dickinson公司(直径 6.5 mm，孔径8 μm)，分为上室与下室，两室底面均由明胶包被，两室之间由聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)膜相隔;普通平底96孔板，戊二醛(普通分析纯，溶于PBS缓冲液)，结晶紫，十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，均购于江苏碧云天(Beyotime)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RNAi试验 取人胶质瘤细胞系U251接种于24孔培养板，常规培养至约70%细胞覆盖密度，吸走培养液，换含血清、无抗生素培养液继续培养至约90%覆盖密度，换无血清、无抗生素的DMEM培养基，12 h后分别加入预设计人双链siRNA片段及对照人双链siRNA阴性对照片段，至终浓度均为10 nmol/L;孵育4 h，吸走并弃去原培养液，换普通培养液;48 h后运用RT-PCR检测SPARC表达，按照标准步骤操作，引物设计及反应条件参照Sato等［5］报道，同时扩增磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照;运用Quantity One4.62软件分析凝胶电泳结果，以SPARC/GAPDH半定量评价SPARC表达改变。

1.2.2 细胞增殖试验 取人胶质瘤细胞系U251随机分为SPARC组及对照组，分别以SPARC-siRNA及对照siRNA处理后重悬于含血清的DMEM培养基中，以每孔5×103的密度接种于96孔板;24 h后吸走培养液，PBS冲洗2次，MTT溶液染色10 min，PBS冲洗3次，分光光度计测量波长为570 nm的OD值;48、72 h分别重复以上操作，各时间点分别测量SPARC组及对照组各6孔OD值，绘制生长曲线。

1.2.3 细胞迁徙试验 参照 Yang等［6］报道的方法。同上分组、处理及重悬U251细胞，按1×105/孔密度接种于Boyden Chamber上室，下室加入含10%血清的DMEM培养液;8 h后以4%甲醛固定，0.1%结晶紫染色，小棉签小心拭去PET膜上室面的细胞;运用Quantity One4.62软件计算每组6个随机视野的细胞数。

1.2.4 细胞黏附试验 参照Rempel等［7］报道的方法。同上分组、处理及重悬U251细胞，按5×104/孔注入96 孔培养板，置于细胞培养箱，0.5、1、2 h 后以350 r/min水平摇床震荡5 min，吸走培养液、PBS缓冲液冲洗2～3次(除去全部未贴壁细胞);1%戊二醛固定已贴壁细胞30 min，PBS冲洗后0.1%结晶紫染色10 min，PBS冲洗，用1%SDS溶液洗脱非细胞染色的结晶紫;分光光度计测量吸收光波长为540 nm处的OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理。单因素方差分析(One-way ANOVA)用于检验组间增殖及黏附实验结果，两独立样本均数t检验用于检验组间迁徙能力，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 RNAi下调SPARC表达的效果 与阴性对照者比较，siRNA试剂处理后U251细胞SPARC表达约下降70%，其半定量值分别为 0.61 ±0.11、0.18±0.05(P ＜0.05);凝胶电泳图见图1。

图1 siRNA处理后SPARC表达的凝胶电泳图

2.2 SPARC-siRNA处理后细胞增殖、迁徙及黏附能力变化 ①细胞增殖:两组细胞生长曲线见图2，其中48、72 h时点SPARC组OD值显著低于对照组(P＜0.05)。②细胞迁徙:SPARC组及对照组嵌于Boyden Chamber的PET下室面(即通过迁移运动穿越了PET膜)的细胞数分别为(357±59)、(546±86)个/视野(P ＜0.05)，见图 3。③细胞黏附:SPARC组细胞黏附速度明显慢于对照组(P＜0.05)，见图4。

3 讨论

图2 SPARC组及对照组细胞生长曲线

图3 细胞迁徙试验随机视野图

图4 SPARC组及对照组细胞黏附能力

随着核磁共振(MRI)等影像学方法的广泛应用，胶质瘤的诊断水平得到显著提高，但手术切除仍是治疗神经胶质瘤的惟一有效手段，而胶质瘤患者的生存时间在过去20 a中并无明显改善［1］。因此，探索手术切除之外的胶质瘤治疗新方式显得尤为迫切。近年来，SPARC蛋白已经引起越来越多肿瘤研究者的关注，其表达在各肿瘤中不尽相同，在胰腺癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌中表达下调或者失活，而在胶质瘤及黑色素瘤中表达增强［4，8］。深入的功能实验证实，SPARC参与了增殖、迁移、侵袭、远处转移等肿瘤发展进程;在众多人类肿瘤中，SPARC作为一个失活了的抑癌基因参与肿瘤的进展。但在胶质瘤中，增强表达的SPARC却扮演一个促癌基因的角色。Rempel等率先报道了在细胞外基质的微环境下，SPARC蛋白可调节胶质瘤细胞的生长、黏附及迁徙，且此调节能力与分泌型SPARC蛋白的浓度有关［7］;随后在体研究得出与此相似的结果，同时发现SPARC可延缓胶质瘤细胞生长，但却增强其侵袭能力［9］，此虽可部分解释SPARC异常高表达与胶质瘤恶性程度呈正相关的临床现象［4］，却未能完全阐述清楚SPARC在胶质瘤发生、发展中的具体作用。

RNAi是近年兴起的一项分子生物学实验技术，是由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录抑制基因表达:当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。运用该技术便于从另一个角度(即从过表达到失活表达)研究SPARC的肿瘤相关功能。本实验结果显示，与阴性对照者比较，siRNA试剂处理后U251细胞SPARC表达约下降70%，其半定量值分别为0.61 ±0.11、0.18 ±0.05(P ＜0.05)。提示 RNAi可显著下调SPARC表达。本研究还显示，与对照组比较，SPARC组U251细胞增殖明显变慢、迁徙活动减弱。此与以上所述运用分子转染技术的实验结论相一致，显示SPARC确实可正向调节胶质瘤的增殖与迁徙活动。Seno等［10］研究亦认为，下调SPARC表达可抑制体外胶质瘤细胞迁徙活动，但具体机制尚未明了。众所周知，细胞迁徙是通过胞体形变进行的定向移动，而变形后的细胞一般需要重新黏附到所运动到达的新表面，因此黏附能力对于细胞迁徙活动十分重要。本研究显示，siRNA处理后的U251细胞黏附能力亦明显减弱。提示SPARC可能通过改变胶质瘤细胞的黏附能力而调控其迁徙活动，并进而促进胶质瘤的侵袭转移。

总之，SPARC可通过增强细胞增殖、迁徙及黏附能力而促进胶质瘤的进展，有望成为一个具有肿瘤特异性的基因敲除治疗靶点。

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