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醒脑静注射液调控NF-κB信号通路对脓毒症心肌损伤的影响

2012-06-15胡丹丹

中国中医急症 2012年8期
关键词:醒脑脓毒症细胞因子

胡丹丹 陈 伟 孙 鑫

(1.浙江中医药大学附属第三医院,浙江 杭州 310005;2.上海中医药大学附属龙华医院,上海200030)

脓毒症是严重创伤、感染、休克等多种应激状态下的常见并发症,发病率高,死亡率高。脓毒症死亡与其易导致多脏器功能损伤有密切关系。脓毒症中医辨证多从毒、瘀、痰入手,但在脓毒症心肌损伤时患者多表现为毒热神昏,治疗当以醒神开窍祛除瘀毒。因此,本研究以大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)法建立脓毒症模型,观察醒脑静注射液对脓毒症大鼠的心脏保护效应,探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性 Wistar大鼠,清洁级,体质量(200±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。造模前适应性喂养7 d。

1.2 主要仪器低温离心机 (Eppendorf Centrifuge 5804德国);紫外分光光度计(BECKMANDU-600,美国);电泳转膜装置(Bio-RAD,美国);数显恒温水浴锅(泰州市华普达教学仪器有限公司);Model 550 酶标仪(Bio-Rad,美国);Bio Sen SC300 凝胶图象分析系统(上海山富科学仪器有限公司);PTC-225 Peltier Thermal Cycler(MJ Research Inc,Waltham,Massachusetts);Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler (Corbett Reseach,Sydney,Australia)等。

1.3 药物与试剂醒脑静注射液(无锡济民可信山禾药业股份有限公司生产,批号:国药准字Z32020563)。戊巴比妥钠(上海西塘生物科技有限公司)。氯仿,异丙醇,二硫代苏糖醇(DTT)(0.1 mol/L),RNasin(40 U/μL),dNTP(10 mmol/L),随机引物,D NaseI(5 U/μL),逆转录酶,SYBRI,50×Calibration,HS ExTaq 酶及 10×Buffer等;大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(烟台赛尔斯公司);Light Shift化学发光凝胶迁移实验(EMSA)试剂盒(Pierce,美国);核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);Bradford蛋白质定量试剂盒(天根生化科技有限公司);Trizol Reagent(Invitrogen,美国)。

1.4 模型制备参照文献[1]报道以CLP法制备脓毒症模型。

1.5 分组及给药大鼠分为6组:正常组、假手术组、模型6 h组、模型24 h组、醒脑静6 h组及醒脑静24 h组,每组8只。正常组与其余各组同步饲养,麻醉后腹主动脉采血处死;模型6 h组、醒脑静6 h组行CLP术后,分别尾静脉注射0.9%氯化钠注射液5 mL/kg、醒脑静注射液5 mL/kg;模型24 h组、醒脑静24 h组行CLP术后,分别于0、6、12 h尾静脉注射0.9%氯化钠注射液5 mL/kg、醒脑静注射液5 mL/kg。

1.6 标本采集与检测模型6 h组、醒脑静6 h组和模型24 h组、醒脑静24 h组分别于CLP术后6、24 h麻醉并腹主动脉采血处死留取标本行相关指标检测。假手术组麻醉后开腹翻动肠道,关腹,24 h后麻醉,腹主动脉采血处死,留取标本行相关检测。(1)使用自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。(2)ELISA 检测心肌组织 TNF-α 蛋白含量,按试剂盒说明书进行操作。(3)荧光定量PCR(PT-PCR)法检测心肌组织TNF-α mRNA表达。Trizol常规法抽提各组心肌组织总RNA,去除基因组DNA;RNA定量后逆转录为cDNA;引物TNF-α:5'–TCCTTCAGACACCCTCAACC-3';3'-AGGCCCCAGT TTGAATTCTT-5',GAPDH:5'-GAGTCAACGGA TTTGGTCGT-3';3'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-5'。 取样本总 cDNA 1 μL、上游和下游引物各0.5 μL,加入试剂盒其他成分,样品TNF-α、GAPDH循环条件为:94℃预变性5 min;接着进行45个循环,95℃变性 30 s,58℃退火 30 s,72℃延伸 40 s;最后 72℃延伸5 min。将预试验的PCR产物以10倍浓度梯度进行稀释,选择1/10000,1/100000,1/1000000,1/10000000 浓度的稀释产物作为标准品模板,进行荧光定量PCR反应并同时在荧光定量PCR仪中输入以上4个浓度梯度的数值。通过这4个标准品生成的反应数据,软件Rotor-Gene6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系,生成标准曲线。通过此标准曲线来计算在标准曲线所划定的CT值。以GADPH为内参,计算目的基因与GADPH的比值,比值即为扩增产物定量相对值。(4)EMSA法检测心肌组织NF-κB活性。按核蛋白提取试剂盒说明书提取核蛋白,Bradford法测定核蛋白浓度。 核转录因子-κB(NF-κB)的探针序列:生物化标记,5'-AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC-3';3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'。按照试剂盒的说明书要求操作,配制20μL检测结合反应体系,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,固定,化学发光检测生物素标记DNA,X线下曝光显影,用分析软件将图片上的特异条带灰度值数字化。

1.7 统计学处理采用SPSS17.0统计软件。计量资料以(±s)表示,多组间比较采用方差分析,相关性分析采用简单线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌酶谱变化见表1。模型24 h组、醒脑静24 h组、模型6 h组、醒脑静6 h组心肌组织CK-MB、CK均较假手术组明显升高(P<0.05);模型24 h组、醒脑静24 h组心肌组织CK-MB、CK均较模型6 h组、醒脑静6 h组明显升高(P<0.05或0.01);模型24 h组心肌组织CK-MB、CK水平高于醒脑静24 h组(P<0.05);模型6 h组心肌组织CK-MB、CK水平高于醒脑静6 h组(P<0.05)。

表1 各组大鼠心肌酶CK-MB、CK比较(U/L,±s)

表1 各组大鼠心肌酶CK-MB、CK比较(U/L,±s)

与模型组同时间点比较,*P<0.05,**P<0.01;与假手术组比较,△P<0.05,△△P<0.01。下同。

组 别 n CK-MB CK正常组 8 2083.10±659.52 1001.87±254.07假手术组 8 2199.35±559.58 1195.40±248.37模型 6 h组 8 3230.85±644.83△ 1774.72±505.86△醒脑静 6 h组 8 2578.88±532.98*△ 1331.58±309.94*△模型 24 h组 6 4218.55±384.55△△ 3234.75±569.31△△醒脑静 24 h 组 6 3559.27±345.67*△△ 1969.45±542.61*△△

2.2 各组大鼠心肌组织TNF-α水平变化见表2。模型24 h组、醒脑静24 h组、模型6 h组、醒脑静6 h组心肌组织TNF-α含量及TNF-α mRNA表达均高于假手术组 (P<0.05或0.01),模型24 h组、醒脑静24 h组心肌组织TNF-α含量及TNF-α mRNA表达均较模型6 h组、醒脑静6 h组降低(P<0.05);醒脑静24 h组心肌组织TNF-α含量及TNF-α mRNA表达低于模型24 h组 (P<0.05);醒脑静 6 h组心肌组织 TNF-α含量及TNF-α mRNA 表达低于模型 6 h组(P<0.01)。

表2 各组大鼠心肌组织TNF-α水平比较(±s)

表2 各组大鼠心肌组织TNF-α水平比较(±s)

组 别 n TNF-α蛋白含量(ng/mL) TNF-α mRNA表达正常组 8 12.6808±0.8651 1769.1078±172.0320假手术组 8 13.4787±2.2911 2018.1289±174.1766模型 6 h组 8 23.8726±2.0491△△ 19840.8051±1169.1709△△醒脑静 6 h组 8 18.1155±3.3767**△ 16816.4239±367.6749**△△模型 24 h组 6 20.2241±1.1088△△ 5772.4474±418.5459△醒脑静 24 h组 6 16.7476±2.3094*△ 3560.0677±418.5459*△

2.3 各组大鼠心肌组织NF-κB表达变化见表3,图1。模型24 h组、醒脑静24 h组、模型6 h组、醒脑静6h组心肌组织NF-κB蛋白表达均高于假手术组(P<0.05或0.01),模型24 h组、醒脑静24 h组心肌组织NF-κB蛋白表达均较模型6 h组、醒脑静 6 h组降低(P<0.05);醒脑静24 h组心肌组织NF-κB蛋白表达低于模型24 h组(P<0.05);醒脑静6 h组心肌组织NF-κB蛋白表达低于模型6 h组(P<0.01)。

表3 各组大鼠心肌组织NF-κB活性比较(±s)

表3 各组大鼠心肌组织NF-κB活性比较(±s)

组 别 n NF-κB正常组 8 2895.1217±161.9397假手术组 8 3192.9800±643.0317模型 6 h 组 8 5589.6167±348.8476△△醒脑静 6 h 组 8 4120.2967±302.7574**△△模型 24 h 组 6 4476.6033±211.9653△醒脑静 24 h 组 6 3801.7850±424.2036*△

图1 各组NF-κB活性变化

2.4 心肌酶与TNF-α、NF-κB相关性分析线性回归分析示:各组大鼠 CK、CK-MB与各组心肌组织 TNF-α蛋白、TNF-α mRNA表达及NF-κB活化呈正相关(P<0.01);心肌组织TNF-α mRNA表达和TNF-α蛋白合成成正相关,相关系数r为0.674(P<0.01);TNF-α蛋白合成水平和NF-κB活性改变成正相关,相关系数 r为 0.732 (P<0.01); 而 NF-κB活性改变与 TNF-α mRNA表达水平呈正相关,相关系数r为0.682(P<0.01)。

3 讨 论

对于脓毒症的发生机制,现较公认的涉及内毒素释放、细胞因子分泌异常、凝血通路异常、基因多态性、细胞信号传导异常等因素,但最与临床符合的为细胞信号传导异常,导致细胞因子释放异常,继而导致器官损伤。在细胞信号传导中研究最为广泛的为NF-κB信号传导通路。NF-κB广泛存在于多种细胞,参与机体免疫应答和炎症反应,能与许多细胞因子和炎症介质的基因启动子区域的固定核苷酸序列结合,启动TNF-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6等细胞因子的基因表达,调控NF-κB活性及其相关信号转导通路能有效抑制多种炎症介质的超量释放,阻止失控的炎症反应,对脓毒症的治疗具有重要意义。因此本研究观察了NF-κB表达及其下游细胞因子表达的情况,通过对该通路的观察了解醒脑静注射液对抗脓毒症心肌损害的作用机制。

脓毒症患者多因久病体衰,或外伤卒病,致使机体正气不足,气血阴阳失衡,卫外不固,令邪毒有内侵之机。外来之毒扰乱机体正常代谢及功能,入里化热,变生热毒;热毒煎熬血液,加之气虚无以行血,则血流瘀滞,津液停化为痰浊,毒热、瘀血、痰浊等内生之毒随之而生;内外之毒相互蕴结,阻遏三焦气机,灼伤气阴及脉络,脏真受损,机体阴阳气血逆乱,内生更多毒邪,形成恶性循环。因此,清热解毒以祛除外来、内生之毒邪,是治疗脓毒症的核心环节之一。醒脑静注射液由安宫牛黄丸经减味而成,主要成分为麝香、冰片、栀子,具有清热泻火,凉血解毒之效。既往研究表明其能抑制TNF-α、IL-6和IL-1表达[2],减轻内毒素诱导的脓毒症肺损伤[3],但未对脓毒症心肌损伤进行研究,也未进一步从炎症信号传导通路进行深入机制研究。本研究数据显示,CLP术后,模型6 h组CK-MB、CK均出现不同程度的升高,模型24 h组则显著高于假手术组和模型6 h组(P<0.05)。表明随着时间延长,脓毒症心肌损害逐渐加重。而醒脑静6 h组和醒脑静24 h组心肌酶学指标均较模型组降低,同时醒脑静24 h组心肌酶学低于醒脑静6 h组,表明随着醒脑静的使用,可以减轻细菌毒素诱导的脓毒症心肌损害,证明醒脑静注射液对脓毒症心肌损伤具有保护作用。

本研究显示脓毒症大鼠模型6 h组、模型24 h组大鼠心肌组织中TNF-α基因转录蛋白合成、NF-κB活化均明显增高,且模型24 h组较模型6 h组上述指标明显升高,这种升高与模型组各组心肌酶学指标升高相似。而在醒脑静6 h组和24 h组,上述指标虽较假手术组高,但升高程度明显低于模型6 h组和模型24 h组,证明醒脑静注射液可以调控NF-κB信号通路表达,进一步对上述指标进行相关性分析显示:TNF-α蛋白合成与NF-κB激活存在正相关,NF-κB激活与 TNF-α mRNA水平升高亦存在正相关,而TNF-α mRNA转录与TNF-α蛋白合成也存在正相关,并且心肌酶学改变与TNF-α蛋白、NF-κB激活呈正相关。提示脓毒症大鼠在造模后出现的心肌酶学异常与NF-κB激活,进而促进细胞因子TNF-α蛋白表达增多有关。证明醒脑静注射液可抑制TNF-α,调节NF-κB信号转导通路,进而抑制脓毒症炎症和免疫反应,改善脓毒症心肌损伤也进一步证实了清热解毒疗法在脓毒症治疗中的作用机制。

[1]金惠铭.盲肠结扎穿剌后的大鼠败血症模型[J].中国病理生理杂志,1990,6(2):126-128.

[2]陈坚,张素平,徐武华,等.醒脑静注射液对急性脑出血患者血中细胞因子水平影响的研究[J].中国中西医结合急救杂志,2004,11(4):224-226.

[3]王进,杨光田,乔礼芬,等.醒脑静注射液对内毒素诱导大鼠肺泡巨噬细胞核转入因子-κb激活和细胞因子产生的影响[J].中国中西医结合急救杂志,2008,15(4):212-215.

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