张亚红，米亚娴，高立勤，吴 燕，袁雯玮

(天津市药品检验所，天津 300070)

妥布霉素是黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)发酵液中提取得到的具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素，对革兰阳性菌和阴性菌均有良好的抗菌作用，尤其对铜绿假单孢菌感染具有高效的抗菌作用。据文献报道[1]，该链霉菌发酵液中除妥布霉素外，尚存在含量不等的10多种其他氨基糖苷组分，且这些组分理化性质与妥布霉素近似。由于该品种缺乏紫外吸收，为了严格控制产品质量，《美国药典》31版采用TLC法测定有关物质，《英国药典》2008和《欧洲药典》6.0均采用高效液相色谱-脉冲电流检测器法，杨茂俊[2]等采用柱前衍生化法测定这些氨基糖苷有关物质的含量。

衍生化法和TLC法操作烦琐，实验条件对结果影响较大，脉冲电流检测器价格昂贵，国内不普及。近年来国内外陆续有文献报道采用蒸发光散射检测技术分析氨基糖苷类抗生素[3-5]。本文建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定妥布霉素的有关物质，为该技术的进一步推广和应用提供实验基础。

1 材料

岛津HPLC高效液相色谱仪；Alltech ELSD 2000蒸发光散射检测器；妥布霉素标准品(中国药品生物制品检定所，批号0340-200002Z，每1 mg相当于880 U)；卡那霉素B标准品(中国药品生物制品检定所，批号130548-200501)；暗霉胺标准品(某国外企业提供)；妥布霉素为国内A药厂(编号为1#、2#、3#)、B药厂(编号为4#、5#、6#)和C药厂(编号为7#、8#、9#)提供。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Phenomenex Gemeni色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.2 mol/L的三氟醋酸为流动相；流速：0.4 ml/min；柱温：30 ℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度：110 ℃；载气流速：3.0 L/min；灵敏度Gain=1；撞击器模式：off模式。进样量：10 μl。

2.2系统适用性试验 取妥布霉素标准品和卡那霉素B标准品适量，加水制成每1 ml中约含0.25 mg的混合对照溶液，照上述色谱条件进样10 μl，记录色谱图，见图1。妥布霉素峰与卡那霉素B峰能完全分离，分离度为1.61，妥布霉素峰的对称因子为1.16 ，理论板数按妥布霉素峰计为11 744。

2.3溶液制备

2.3.1供试品溶液 取本品，用水溶解并定量稀释成每1 ml中约含4 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.3.2对照溶液 精密量取供试品溶液适量，加水定量稀释制成每1 ml中约含12 μg(0.3%)、24 μg(0.6%)和48 μg(1.2%) 的溶液，作为对照溶液(1)、(2)、(3)。

1.卡那霉素B 2.妥布霉素图1 系统适用性试验色谱图

2.4线性关系及最低检出限 取妥布霉素、暗霉胺、卡那霉素B对照品各约25 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4、6、8、10和25 ml，分别置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系列浓度线性溶液，精密量取线性溶液各10 μl，依“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，以对照溶液浓度的对数值与相应的峰面积的对数值计算回归方程，结果线性范围分别为：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，妥布霉素、暗霉胺和卡那霉素B的回归方程及相关系数分别为Y=1.625 8X+0.973 5(r=0.999 7)、Y=1.621 2X+0.829 1(r=0.999 4)和Y=1.628 7X+0.760 5(r=0.997 1 )。以妥布霉素计，本方法最小检出浓度为5.80 μg/ml。

2.5稳定性试验 取供试品溶液在室温分别放置0、1、2、4、6和8 h时，依“2.1”项下色谱条件进样，测定并计算有关物质含量，结果表明：供试品溶液在室温放置8 h内稳定。见表1。

表1 供试品溶液室温放置稳定性测定结果

2.6样品测定 精密量取对照溶液和供试品溶液各10 μl，依“2.1”项下色谱条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，用回归方程计算供试品中各杂质的含量。采用建立的HPLC-ELSD法测定三个厂家的妥布霉素，发现主要杂质为暗霉胺，其次为卡那霉素B，产品质量较高的样品，单个杂质的含量在0.2%以下，氨基糖苷杂质总量不超过0.5%。样品测定结果见表2。根据新霉胺、暗霉胺与卡那霉素B标准品分别测定得到的保留时间定位，供试品溶液色谱图见图2。

表2 样品有关物质测定结果

1.新霉胺 2.暗霉胺 3.卡那霉素B 4.妥布霉素图2 典型供试品溶液色谱图

3 讨论

3.1计算方法的选择 蒸发光散射检测器为质量型检测器，其工作原理为散射光的对数响应值与组分质量的对数值呈线性关系，即供试品溶液浓度的对数值与相应峰面积的对数值呈线性，故不宜用单点的对照溶液峰面积作比较。只能通过自身对照线性回归方程来计算有关物质的含量。

3.2校正因子的测定 在方法研究时，对妥布霉素以及已知杂质卡那霉素B、暗霉胺进行了校正因子的测定，浓度范围分别为：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，暗霉胺与卡那霉素校正因子分别为0.997 2和1.008 1，因此本方法计算时可不加校正因子。

3.3对照溶液的选择 试验证明，不同pH值的供试品溶液经HPLC分析，用蒸发光散射检测器检测时，其响应值有较大的差异。为保证结果的正确性，供试品溶液与对照溶液的pH值应一致。故本标准采用供试品溶液稀释的自身对照法。

测定三个浓度(0.3%、0.6%和1.2%)和六个浓度(0.25%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)的自身对照溶液并进行线性回归，用上述两个回归方程分别计算杂质含量，结果基本一致，考虑本方法为有关物质检查，采用三个浓度的回归方程法，足以满足测定结果精度要求，故本方法规定用0.3%、0.6%和1.2%三个浓度作为自身对照溶液的三个浓度。

3.4分离度参照物的选择 依据“2.1”项下色谱条件，对妥布霉素中可能存在的有关物质卡那霉素B、新霉胺及暗霉胺进行考察，结果出峰顺序依次为新霉胺、暗霉胺、卡那霉素B和妥布霉素，卡那霉素B与妥布霉素保留时间最为接近，且卡那霉素B标准品容易获得，故用来作为系统适用性试验中测定分离度的参照物。

1 Koch K F,Merkel K E,O’Connor S C，etal.Structures of some of the minor aminoglycoside factors of the nebramycin fermentation. J Org Chem，1978，43:1207

2 杨茂俊，吴章秀.高效液相色谱法分析国产妥布霉素及有关物质.中国抗生素杂志，1996，21(s)：73

3 王明娟，胡昌勤，金少鸿.采用HPLC-ELSD法分析小诺米星及其有关物质.药物分析杂志，2002，22(3)：205

4 王明娟，胡昌勤，金少鸿.高效液相色谱-蒸发光散射检测法分析庆大霉素C组分. 药物分析杂志，2002，22(6)：461

5 Vogel R,DeFillipo K,Reif V.Determination of isepamicin sulfate and related compounds by high performance liquid chromatography using evaporative light scattering detection. J Pharm Biomed Anal,2001,24(3):405