程 钰，高 伟，朱海峰

（1.西安交通大学医学院第一附属医院眼科，陕西西安710061；2.西安市第一医院眼科，陕西西安710002）

复发型翼状胬肉IL-6与TNF-α的表达研究

程 钰1，2，高 伟2，朱海峰2

（1.西安交通大学医学院第一附属医院眼科，陕西西安710061；2.西安市第一医院眼科，陕西西安710002）

目的探讨复发型翼状胬肉中IL-6与TNF-α的表达变化及其临床意义。方法采用酶标记免疫吸附测定法（ELISA）分别检测20例原发型和20例复发型患者翼状胬肉组织的体外培养上清液中白细胞介素IL-6与TNF-α的含量（24小时培养）。结果复发型翼状胬肉组织培养上清中IL-6与TNF-α的含量分别为57.62±8.00 pg／mL与117.69±4.20 pg／mL，均高于原发型的41.22±5.21pg／mL与97.99±2.34pg／mL，且差异明显（P＜0.08）。结论IL-6和TNF与翼状胬肉的复发可能相关。

翼状胬肉；白细胞介素6；肿瘤坏死因子α

翼状胬肉（pterygium）是一种常见的眼表疾病，治疗方式以手术为主，但是复发率较高，单纯翼状胬肉切除术后复发率高达30%～50%［1］，因此，深入探究翼状胬肉复发的原因成为迫切的现实需要。近期的免疫组化研究发现，外界环境中的危险因子（以紫外线照射为主，不排除风沙、粉尘、花粉刺激、与感染等的影响）引起血管内皮生长因子、炎症因子的过度表达以及细胞内野生型抑癌基因P53突变，可能是翼状胬肉复发的原因，但是目前尚无定论［2］。IL-6和TNF-α是重要的炎症因子，同时又是P53表达与变异影响的关键下游细胞因子，且P53对IL-6和TNF-α有着负调节作用［3］。因此，测定及比较原发与复发型翼状胬肉组织中IL-6和TNF-α的含量，可初步探讨炎症因子与翼状胬肉复发之间的联系，并验证P53与胬肉复发的相关性，为预防复发的药物治疗提供有益的靶点信息。

1 材料和方法

1.1 材料

二氧化碳培养箱MCO-20AIC（SANYO），酶标仪TecanF50（瑞士），超净工作台SW-CJ-2FD（苏州净化设备有限公司），四季青无支原体优级胎牛血清（上海越研生物科技有限公司），TNF-α、IL-6的ELISA试剂盒（均为96人份，上海恒远生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 取材与培养 翼状胬肉组织全部来自西安市第一医院眼科住院部的初发和复发翼状胬肉手术患者。第一组（A组），原发型（20例20只眼）；第二组（B组），复发型（20例20只眼）；两组均无其它角膜、结膜疾患。复发翼状胬肉患者第一次手术进行翼状胬肉切除联合羊膜移植术，手术均在我院进行，术后3个月至1年后复发，尽量排除手术原因造成的复发。同时两组患者在年龄、性别、职业以及居住地均进行了配对以尽量减少实验误差。所有翼状胬肉组织手术切除后迅速置于含100mL／L胎牛血清（FCS）的RPMI1640（Gibco）培养液（1.0mL）中。置于37℃温箱孵育24h。

1.2.2 组织培养上清的制备 24h后取翼状胬肉组织研磨匀浆，以2500r／min离心20min，收集上清，置于-20℃冰箱保存，IL-6和TNF-α含量待测。

1.2.3 ELISA法测定组织上清IL-6和TNF-α含量按照ELISA试剂盒说明配制洗涤液、底物工作液、标准品液。激活标本后，分别建立IL-6、TNF-α标准曲线，并测定组织上清中与IL-6与TNF-α的含量。

1.2.4 统计学处理 利用SPSS13.0统计软件，每份标本平行测定2孔，取平均值，各组间均数比较采用配对t检验。

2 结果

初发与复发型翼状胬肉中IL-6和TNF-α含量见表1。

表1 各组IL-6和TNF-α含量的比较（ELISA）

由表1可见，与原发型比较，复发型翼状胬肉中IL-6和TNF-α含量均显著升高，且差异明显（P＜ 0.08）。

3 讨论

当前，翼状胬肉手术从单纯手术切除逐渐发展为羊膜移植、自体干细胞移植等眼表重建技术，其目的是尽快恢复角膜缘正常功能，恢复眼表正常环境，进而防治复发。尽管如此，近年文献报道胬肉术后复发率仍然较高，对复发性翼状胬肉的治疗一直是眼科界的一项难题。因此，探讨和研究翼状胬肉术后复发具有重要的理论和临床意义。

现有研究表明，翼状胬肉是基因遗传、免疫反应、细胞凋亡、生长因子和病毒感染等多种机制共同作用的结果［4］，且国内外对翼状胬肉高复发率的原因尚未得出一致结论［5］。Coroneo等认为翼状胬肉的初发可以分为两个阶段［6］：第一阶段，角膜缘干细胞受到破坏，角结膜屏障功能产生障碍；第二阶段，细胞增生，并发生炎症、血管化及结缔组织重塑，角膜“结膜化”，产生翼状胬肉。已经确认翼状胬肉组织主要由大量增生的成纤维细胞构成，并由其导致相应的病变，而细胞因子则在炎症反应及成纤维细胞增生方面起到重要作用［7］。因此，成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、血小板等细胞代谢异常，以及白细胞介素IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子的异常表达在翼状胬肉形成过程中的作用不容忽视［4］。

考察翼状胬肉术后复发，在排除手术因素造成复发的情况后，目前仅能在基因遗传、免疫反应、细胞凋亡、生长因子、以及术后泪膜功能的改变（干眼症）诸方面进行初步的归纳与分析。

第一，基于免疫反应和生长因子的复发。根据Coroneo［6，7］和AI-Bdour［8］等学者对翼状胬肉发病过程的论述，初步判断其复发更符合“增生后变性”的特征。在以紫外线照射为主的危险因子（包括风沙、粉尘、花粉刺激、感染等）的作用下，翼状胬肉头部成纤维细胞与血管大量增生，且成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、血小板及多种细胞因子相互作用，最终导致细胞因子的异常分泌及球结膜的蛋白变性。所以，免疫因素在翼状胬肉的发病过程中起到重要的作用。目前，在翼状胬肉中检测到的生长因子包括IL-6、TNF-α、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、和生长转化因子（TGF-β）等。它们在正常细胞中不同程度的有序表达，但是在胬肉组织中表达紊乱［9］。其中，IL-6和TNF-α是一组重要的炎症因子，可以促进纤维母细胞的繁殖和血管的形成，而纤维母细胞的增生又能促进IL-6和TNF-α的分泌表达，形成恶性循环，促进翼状胬肉的发展。本课题数据表明，复发型翼状胬肉中IL-6和TNF-α含量较原发型均呈升高表达趋势，说明对于复发性翼状胬肉患者，其结膜组织中IL-6和TNF-α这两个重要炎症因子起着促进纤维母细胞的繁殖和血管的形成作用，应是造成翼状胬肉复发的主要原因。同时我们还发现IL-6和TNF-α的表达同时增高；而在通常状态下，TNF-α是IL-6的强诱导剂，IL-6则对TNF-α起着抑制作用［10，11］。这很可能意味着复发型中其它细胞因子或危险因素促进了TNF-α的高表达，而IL-6的分泌并非完全依赖于TNF-α诱导。这也说明在翼状胬肉复发中存在着其它细胞因子或危险因素，胬肉复发可能是多种因素共同作用的结果，而IL-6和TNF-α等炎症因子则成为它们共同作用的通路。

第二，基于基因遗传的复发。近期研究证实，翼状胬肉组织具有良性肿瘤组织的特性，且常见的引起人类肿瘤发生的突变型P53基因在翼状胬肉上皮中过度表达［12］。本课题数据表明，复发型翼状胬肉中IL-6和TNF-α含量较原发型有明显升高，可能说明单纯翼状胬肉切除术未能降低眼表组织中IL-6和TNF-α上游物质（如P53基因等）的表达与突变水平。P53基因在紫外线等危险因子的刺激下变异并过度表达，会引发IL-6和TNF-α分泌表达的反复与紊乱，促使翼状胬肉成纤维细胞呈现可以传代的生长变异性。故有学者认为复发型翼状胬肉组织细胞一定发生了转化，具有与肿瘤相似的分子生物学特性，可以认为是一种良性肿瘤性病变［13］。因此，我们推测翼状胬肉治疗方式除了手术切除外，似应辅以抑制P53突变与过度表达的药物治疗，抑制IL-6和TNF-α的分泌，最终达到降低复发率的效果。

第三，基于术后泪膜功能改变（干眼症）的复发。翼状胬肉的生成可以引起结膜鳞状上皮化生，杯状细胞密度增加，影响泪膜表面的稳定性。胬肉切除术也会影响泪膜功能［14］。Zakaria等研究显示：泪膜功能改变（干眼症）对胬肉的发生发展有促进作用，是胬肉复发的重要危险因素之一［15］。眼表黏蛋白是一组高度糖基化的大分子蛋白质，由角膜、结膜、泪器产生，是泪膜的重要成分，在抵御紫外线、干燥、化学品接触的侵害方面起到重要作用。翼状胬肉上皮处于高度增殖状态，上皮细胞角化和增值活跃使细胞从分裂、移动、到成熟所需时间缩短。在此情况下，增殖的细胞没有足够的时间合成黏蛋白，导致泪液中黏蛋白含量降低，泪膜功能变化，形成干眼。单纯胬肉切除术中，黏蛋白并未得到修复，可诱发干眼。干眼则会引发结膜和角膜上皮细胞分泌IL-6，TNF-α等致炎细胞因子，再通过基因遗传、免疫反应或生长因子途径引起胬肉复发［16］。本课题的数据确认了致炎细胞因子IL-6和TNF-α对翼状胬肉复发的影响，也构成干眼症与翼状胬肉复发相关性的必要条件之一。

翼状胬肉的复发是一个复杂的病理过程，上述三种假设均建立在实验基础上，各有其合理性，而现实中翼状胬肉的复发则很可能是三种途径交互作用的结果。由于样本量、样本大小、实验环境、个体差异等原因，可能某种或某几种途径占主导地位。但是，基于文献报道结果和本课题的研究数据，证明IL-6和TNF-α与翼状胬肉的复发密切相关。

［1］Thoratoay SC.Interaction of immune and connective tissue cells，the effect of lymphokines and monokines on fibroblast growth［J］.JLeuko Biol，1990，47（4）：312-316.

［2］Hill JC，Maske R.Pathogenesis of pterygium［J］.Eye，1989，3（2）：218-226.

［3］Khalfaoui T，Mkannez G，Colin D，etal.Immunohistochemical analysis of vascular endothelial growth factor（VEGF）and p53 expression in pterygium from Tunisian patients［J］.Pathol Biol（Paris），2011，59（3）：137-141.

［4］Hirst LW.The treatment of pterygium［J］.Surv Ophthalmol，2003，48（2）：145-180.

［5］杨文蕾，张琳.翼状胬肉与干眼的相关性研究［J］.上海交通大学学报（医学版），2008，28（6）：739-742.

［6］Coroneo MT，Girolamo ND，Wakefield D.The pathogenesis of pterygia［J］.Curr Opin Ophthalmol，1999，10（4）：282-288.

［7］Coroneo MT.Pterygium as an early indictor of ultraviolet insolation：a hypothesis［J］.Br JOphthalmol，1993，77（11）：734-739.

［8］AI-Bdour M，AI-Latayfeh MM.Risk factors for pterygium in an adult Jordanian population［J］.Acta Ophthalmol Scand，2004，82（1）：64-67.

［9］邓世清.羊膜在眼科领域应用的基础及临床研究进展［J］.国外医学：眼科学分册，2004，28（6）：345-346.

［10］Aderka D，Le J，Vilcek JM.IL-6 inhibites lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor production in cultured humanmonocytes，U973 cells，and inmice［J］.J Immunol，1989，143（11）：3517-3523.

［11］张俊华，张国安，金威尔，等.翼状胬肉IL-6和TNF-α的异常分泌及其意义［J］.眼科新进展，1999，19（1）：15-17.

［12］Dushku N，Reid TW.P53 expression in altered limbalbasal cells of pingueculae，pterygia，and limbal tumors［J］.Curr Eye Res，1997，16（12）：1179-1192.

［13］Spandidos DA，Sourvinos G，Kiaris H，et al.Microsatellite instability and loss of heterozygosity in human pterygia［J］.Br JOphthalmol，1997，81（6）：493-496.

［14］王时力.翼状胬肉患者手术前后泪膜功能的变化［J］.中国中医眼科杂志，2007，17（6）：336-338.

［15］Zakaria N，De Groot V，Tassignon MJ.Tear film biomarkers as prognostic indicators forrecurrent pterygium.Bull Soc Belge Ophtalmol.2011；3（17）：53-54.

［16］Solomon A，Li DQ，Lee SB，et al.Regulation of collagenase，stromelysin，and urokinase-type plasminogen activator in primary pterygium body fibroblasts by inflammatory cytokines［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（8）：2154-2163.

The study on expression of interleukin 6 and tumor necrosis factor-αin recurrent pterygium

CHENG Yu1，2，GAOWei2，ZHU Hai－feng2

（1.Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University School of Medicine，Xi'an，Shaanxi710061china；2.Department of Ophthalmology，the No.1 Hospital of Xi'an City，Xi'an，Shaanxi710002 china）

ObjectiveTo study the clinical significance of expression of interleukin 6（IL-6）and tumor necrosis factor α（TNF-α）in palindromic pterygium.M ethods Group A included twenty patients'（20 eyes）idiopathic pterygia tissues，and group B covered twenty patients'（20 eyes）palindromic pterygia tissues.After being cultured for 24 hours，tissue supernatant of both groupswas tested for the content of IL-6 and TNF-αby enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）technique.Results The contents of IL-6 and TNF-αin tissue supernatantof group B were 57.62 ±8.00 pg／mL and 117.69±4.20 pg／mL，respectively，which were significantly higher than those of group A（41.22±5.21 pg／mL and 97.99±2.34 pg／mL，respectively，P＜0.08）.Conclusions The expression of IL-6 and TNF-αis probably related to the recurrence of pterygium.

Pterygium；Interleukin 6（IL-6）；Tumor necrosis factorα（TNF-α）

R285.5

A

1672－2639（2012）02－0001－03

2012－04－23；责任编辑 赵菊梅］