王 崇，张松筠，杨长春

（1.河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄050000；2.河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄050000；3.武装警察部队总医院内一科，北京100039）

·论 著·

高碘诱导小鼠海马组织NOS阳性神经元凋亡

王 崇1，张松筠2，杨长春3

（1.河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄050000；2.河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄050000；3.武装警察部队总医院内一科，北京100039）

目的观察高碘喂养小鼠海马组织一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）阳性神经元的变化，探讨高碘对小鼠中枢神经系统损害及行为学的影响。方法选择昆明种初断乳健康小鼠50只（雌雄各25只），随机分为适碘及高碘2组，适碘组小鼠喂碘浓度为50μg/L蒸馏水，高碘组小鼠喂碘浓度为5 000μg/L的蒸馏水各180d，做Morris水迷宫行为学测试，再用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶［nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate （NADPH）-diaphorase，NADPH-d］组织化学染色法观察小鼠海马组织NOS阳性神经元的改变。结果高碘组小鼠海马组织NOS阳性神经元密度较适碘组明显降低，染色变浅；在行为学测试中，小鼠逃避潜伏期明显延长。结论高碘组小鼠海马组织NOS阳性神经元减少及染色变浅，为高碘喂养可对小鼠中枢神经系统造成损害提供了病理依据。

碘；海马；一氧化碳合酶；小鼠

碘是人体重要的微量元素，长期碘缺乏可导致地方甲状腺肿，妊娠期缺碘可造成胎儿中枢神经系统发育不良，智力低下。通过食盐加碘等措施来预防碘缺乏病的发生，起到了明显效果。长期过量补碘也会损害中枢神经系统发育，进而影响学习记忆功能［1-2］。一氧化氮（nitric oxide，NO）是中枢神经及周围神经系统中重要的神经递质及信使，对学习记忆功能起重要作用［3］，而一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是催化L-精氨酸生成NO的关键酶，故NOS活性的高低直接影响NO的合成，进而对学习记忆功能产生影响。海马组织是有关学习记忆功能的重要神经中枢，本研究通过观察高碘喂养小鼠海马组织NOS阳性神经元及小鼠行为学的改变，探讨高碘对学习记忆功能影响的神经机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备：初断乳健康昆明种小鼠50只（由河北实验动物中心提供），体质量11～13g，雌雄各半，随机分为适碘组与高碘组，每组25只，普通饲料喂养，在其饮用蒸馏水中加碘酸钾，其中适碘组碘浓度为50μg/L，高碘组碘浓度为5 000μg/L，喂养至第180d，对2组动物作分别做Morris水迷宫行为测试，然后断颈处死，取甲状腺甲醛固定、脱水、石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光镜下证实高碘组高碘甲状腺肿模型制备成功；然后取脑进行还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶［nicotinamide adenine dinuc1eotidephosphate（NADPH）-diaphorase，NADPH-d］组织化学染色光镜观察海马组织NOS阳性神经元的变化。

1.2 动物行为学测试：按文献［4］所介绍方法对2组动物进行Morris水迷宫行为测试，并记录2组小鼠的逃避潜伏期。

1.3 NADPH-d组织化学反应［5］：将脑组织用4%多聚甲醛灌注固定，置4℃冰箱过夜后，依次移入15%，30%蔗糖磷酸缓冲液中（0.1mo1/L，pH 7.4）于冰箱内放置沉底。连续冰冻冠状切片（所取平面限定于海齿互包平面）片厚20μm，0.1mo1/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）接片，每2～3张取一片，每例取3～4张进行NADPH-d组织化学反应，将切片用1%TritonX-100（pH 7.4）预浸60min后移入孵育液，于37℃温箱中孵育3h，孵育液由（0.5mg NADPH-d，sigma，typeⅠ）、0.5mg硝基四氮唑蓝（nitrob1ue tetrazo1ium，NBT）、1mL磷酸缓冲液（0.1mo1/L，pH 7.4）、1mL 1%TritonX-100组成；0.1mo1/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）冲洗3次，5min/次，终止反应；明胶载片裱片风干，中性红复染，常规脱水，透明封片。

此法神经元显示为蓝黑色，类似Go1gi镀银染色外观，胞体、神经纤维及纤维终末均可染色。每例取5张背侧海马切片，用目镜网格测试系统在40× 10倍显微镜下计数0.01mm2范围内的海马组织NOS阳性神经元数量。

1.4 统计学方法：应用POMS2.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 甲状腺组织形态学观察：结果适碘组，光镜下可见甲状腺滤泡上皮细胞为高柱状或单层立方状，核圆形或椭圆形位于细胞中央，细胞质中等，甲状腺滤泡大小形态不一，腔内有中等量的粉红色胶质，毛细血管丰富（图1）。高碘组，光镜下可见甲状腺滤泡上皮细胞扁平，细胞核呈梭形，滤泡间质减少，甲状腺滤泡明显扩张，腔内充满大量染色的红色胶质（图2）。以上观察结果证实高碘组小鼠高碘甲状腺肿模型复制成功。

2.2 行为学测试结果：高碘组小鼠平均逃避潜伏期较适碘组小鼠明显延长（P＜0.01），见表1。

表1 2组小鼠平均逃避潜伏期及海马NOS阳性神经元密度比较Table 1 The mean escape latency of rats and the denses of NOS-positive cells in the 2 groups （n=25，±s）

表1 2组小鼠平均逃避潜伏期及海马NOS阳性神经元密度比较Table 1 The mean escape latency of rats and the denses of NOS-positive cells in the 2 groups （n=25，±s）

*P＜0.01 vs appropriate iodine group by t testNOS：nitric oxide synthase

GroupsThe mean escape 1atency（t/s）The density of NOS positive ce11s in hippocampus （ce11s/0.01mm2）Appropriate iodine14.5±9.63.2±1.2 Excessive iodine 30.5±12.4*0.7±0.9*

2.3 海马组织NADPH-d组织化学染色结果：适碘组海马内可见排列较为规则的NOS阳性神经元带，胞体较小，紧贴辐射层内缘，胞浆饱满且呈蓝色深染，突起明显，有较多深染纤维（图3）。高碘组海马NOS阳性神经元分布与适碘组一致，细胞形态以梭形或椭圆形为主，胞核不着色，胞浆淡染，细胞密度明显降低（P＜0.01），神经元突起短小或缺如（表1，图4）。

3 讨 论

碘作为人体重要的微量元素，对人体的生长发育及智力发展起着至关重要的作用，为了预防碘缺乏病的发生，国家采取了诸如食盐加碘等补碘措施，并长期推广应用，也起到了明显的预防效果。但近年来有研究［1］表明，长期过量补碘可对中枢神经系统造成损害，影响学习记忆功能。高碘对中枢神经系统的损害与其抑制NOS活性和减少NO的合成有关，NO作为一种新型的神经递质和信息分子在中枢神经系统的信息传递中起着重要作用，而NO是以L-精氨酸为底物在NOS合酶催化下合成，高碘可能通过诱导与学习记忆功能密切相关的海马组织NOS阳性神经元凋亡而降低NOS活性，从而减少NO的合成［6］。

杨长春等［7］报道长期高碘喂养可导致小鼠甲状腺肿，并可使小鼠大脑皮质、海马组织NOS活性降低。本研究结果证实，在应用高碘水喂养小鼠180d后，可致小鼠甲状腺明显肿大，滤泡上皮细胞扁平，核呈梭形，滤泡间质减少，甲状腺滤泡明显扩张，腔内充满大量红色胶质，呈现高碘甲状腺肿特有的形态学改变。表明高碘甲状腺肿动物模型复制成功。在此基础上，通过对小鼠海马组织进行NADPH-d组织化学染色，观察高碘对小鼠海马组织NOS阳性神经元的影响。在中枢神经系统海马组织中NOS的分布与NADPH-d的分布十分相似，NADPH-d染色实际上反映了NOS表达情况［7］。本研究通过对高碘甲状腺肿小鼠海马组织NADPH-d组织化学染色，观察到高碘小鼠海马组织NOS阳性神经元胞核不着色，胞浆淡染，细胞密度降低，神经元突起短小或缺如，纤维变短。说明长期高碘喂养可诱导小鼠海马组织NOS阳性神经元凋亡，NOS活性降低，NO合成减少，致中枢神经系统信息传递延迟或阻滞，造成高碘组小鼠平均逃避潜伏期较适碘组小鼠明显延长。

综上所述，高碘不仅可导致小鼠甲状腺肿，而且可通过诱导小鼠海马组织NOS阳性神经元凋亡抑制NOS活性，减少NO的合成，使小鼠学习记忆功能降低。有研究证明在大鼠海马内注射NOS抑制剂，造成NO含量降低，可使大鼠出现严重的学习记忆功能障碍［6］，说明NO是中枢神经系统重要的信使分子，维持正常浓度的NO对保证学习记忆功能非常重要。由于长期高碘对海马组织NOS阳性神经元的损害可影响学习记忆功能，提醒大家科学补碘，切不可长期过量补碘或滥用碘剂。（本文图见封二）

［1］ 赵金扣，张庆兰，尚莉.高碘摄入与儿童智力水平关系的研究［J］.中国公共卫生，2004，20（5）：516-518.

［2］ 石娟.过量补碘的危害研究进展［J］.现代预防医学，2004，31 （2）：204-205.

［3］ 韩太真，吴馥梅.学习与记忆的神经生物学［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：257.

［4］ GEERT-JAN BIESSELS.P1ace 1earning and hippocampa1 synapti p1asticity in streptozocin-induced diabetic rats［J］.Diabetes，1996，45（9）：1259-1266.

［5］ 熊抗辉，赵经纬，王百忍.还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADPH-d）组化操作步骤中各种参数的选择［J］.神经解剖学杂志，1996，12（1）：79-82.

［6］ HOPE BT，MICHAEL GJ，KNIGGE KM，et a1.Neurona1 NADPH diaphorse is a nitric oxide synthase［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，1991，88（7）：2811-2814.

［7］ 杨长春，尹桂山，朱惠民.过量碘对中枢神经系统影响的实验研究［J］.中国地方病防治杂志，2000，15（2）：65-67.

（本文编辑：赵丽洁）

EXCESSIVE IODINE INDUCES NITRIC OXIDE SYNTHASE POSITIVE NEURONS APOPTOSIS IN HIPPOCAMPUS OF MICE

WANG Chong1，ZHANG Songyun2，YANG Changchun3
（1.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Endocrinology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；3.The First Department of Internal Medicine，Arm Police General Hospital，Beijing 100039，China）

ObjectiveTo observe the effect of excessive iodine on nitric oxide synthase（NOS）positive neurons in hippocampus of mice and exp1ore the injury effect of excessive iodine on centra1 nervous system.MethodsFifty mice，divided into two groups at random（contro1 group with appropriate iodine and tria1 group with excessive iodine），were fed with disti11ed water containing iodine 50μg/L and 5 000μg/L respective1y.The mice were ki11ed at 6 months after Morris water maze.Nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate（NADPH）-diaphorase histochemistry was used to visua1ize NOS positive ce11s in hippocampus.ResultsThe mean escape 1atency increased and NOS positive ce11s decreased significant1y in excessive iodine group than in contro1 group.ConclusionThe reduce of NOS positive ce11s in hippocampus may be re1ated to the injury of cognition in excessive iodine mice.

iodine；hippocampus；nitric oxide synthase；mice

R329.481

A

1007-3205（2012）10-1117-03

2012-03-24；

2012-06-12

河北省科技厅科研指导课题（062761830）

王崇（1972-），男，河北安平人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学硕士，从事临床检验研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.001