周 萍，周 浓，张海珠

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

HPLC同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量

周 萍，周 浓，张海珠

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

目的：建立同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷含量的高效液相色谱方法。方法：Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温为25℃；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（45∶55）；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为265 nm。结果：盐酸小檗碱在1.02~20.40μg·mL-1内线性关系良好（r=0.999 9）；黄芩苷在4.54~90.80μg·mL-1内线性关系良好（r=0.999 8）；盐酸小檗碱、黄芩苷平均加样回收率为99.2%，101.2%，RSD分别为1.1%和1.6%。结论：本方法简便、准确，重现性好，可用于本制剂的质量控制。

高效液相色谱法；明目上清片；盐酸小檗碱；黄芩苷

明目上清片是由黄芩、黄连、当归、陈皮、栀子、连翘、菊花、蒺藜等21味中药材经加工制成，具有清热散风、明目止痛的功效，用于暴发火眼。现收录于《中国药典》2010年版第一部〔1〕，测定黄连中的盐酸小檗碱作为含量控制指标。有文献报道测定明目上清片中黄芩苷的含量〔2〕及橙皮苷的含量〔3〕，但复方中药制剂只测量一种指标成分并不能有效地控制药品的内在质量。中药制剂中同时测定盐酸小檗碱和黄芩苷两种成分含量已有报道〔4-8〕，由于不同制剂所含药材及辅料不同，产生的干扰不同。本实验建立了同时测定明目上清片中黄连、黄芩中的盐酸小檗碱和黄芩苷含量的高效液相色谱法（HPLC）。结果表明该方法简便、灵敏、快速、准确，减少了检验成本，降低工作量，为该药的质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters 600E高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AS20500BDT超声波清洗器（天津奥特塞思斯仪器有限公司）；FA2004N电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超纯水仪（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

1.2 药品与试剂盐酸小檗碱、黄芩苷对照品（含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：110713-200805，110715-200514）。明目上清片为市售品（批号：090301，090501，20090901）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：265 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱和黄芩苷对照品适量分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得各自的对照品溶液，精密量取各对照品溶液适量置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得盐酸小檗碱0.204 mg·mL-1和黄芩苷0.908 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备 取明目上清片20片，去包衣，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1∶100）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（1∶100）混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，临用前以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液制备 按处方比例，分别称取除黄连、黄芩以外的其余药味，依照明目上清片的制备工艺制成相应的阴性样品，再按“2.2.2”项下操作，制成盐酸小檗碱、黄芩苷阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液，按“2.1”项下色谱条件测定。两组分色谱峰与相邻其他色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按盐酸小檗碱计算大于6 000，按黄芩苷计算大于4 000，阴性对照对样品测定无干扰。对照品、样品及阴性对照色谱图，见图1。

图1 盐酸小檗碱和黄芩苷的HPLC图

2.4 线性关系考察依次精密吸取混合对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，用稀盐酸-甲醇（1∶1）稀释至刻度，摇匀，得系列质量浓度的溶液，按上述色谱条件进样10μL分析，记录色谱峰面积。以色谱峰面积Y为纵坐标，对照品浓度X（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：盐酸小檗碱的质量浓度在1.02~20.40μg·mL-1内与峰面积线性关系良好，回归方程为：Y=30 364X+ 27 054，r=0.999 9。黄芩苷的质量浓度在4.54~90.80 μg·mL-1内与峰面积线性关系良好，回归方程为：Y= 36 538X+54 862，r=0.999 8。

2.5 仪器精密度试验取同一混合对照品溶液在上述色谱条件下重复进样6次，盐酸小檗碱和黄芩苷峰面积的RSD分别为0.69%和1.2%。

2.6 重复性试验取同一批样品（批号：090301），按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为2.157 mg·g-1，8.102 mg·g-1，RSD分别为0.98%、1.1%。

2.7 供试品溶液稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h按“2.1”项下色谱条件进样分析，盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积的RSD分别为1.2%和1.4%，结果表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验分别称取已知含量的样品（批号：090301）0.2 g，共9份，按低、中、高质量浓度分别加入盐酸小檗碱、黄芩苷对照品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1、2。

表1 盐酸小檗碱加样回收率试验结果

表2 黄芩苷加样回收率试验结果

2.9 样品测定取“1.2”项下不同厂家生产的样品，每批取3份，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算各组分含量。测定结果见表3。

3 讨论

本实验提取溶剂的考察方法为，分别选取甲醇、70%甲醇、70%乙醇、盐酸-甲醇（1∶100）为溶剂，对同一样品超声提取30 min，比较待测化合物的峰面积，结果表明提取溶剂为甲醇和乙醇时，所得盐酸小檗碱峰面积明显小于以盐酸-甲醇作提取溶剂的峰面积，而黄芩苷色谱峰峰面积的差别不大。本实验考察了超声20、30、40 min3个时间点，发现超声30 min，2种指标成分能够提取完全。因此，本实验样品的制备条件以盐酸-甲醇（1∶100）为提取溶剂，超声30 min。

表3 盐酸小檗碱、黄芩苷含量测定结果（n=3）

紫外扫描显示盐酸小檗碱最大吸收波长为223、265、345 nm处，黄芩苷最大吸收波长为276、324 nm。由于黄芩苷含量高于盐酸小檗碱，本实验选择盐酸小檗碱的最大吸收波长265 nm为检测波长，实验结果表明黄芩苷峰面积在265 nm和276 nm检测结果无明显差别。在265 nm波长下能同时检测盐酸小檗碱和黄芩苷，并保证两成份有适宜的灵敏度。

本实验根据文献报道，分别选用乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氢钾（3∶7）、乙睛-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液-三乙胺（25∶7∶76∶0.23，以磷酸调pH3.1）、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（34∶60∶6∶0.2）、甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-水（含0.05%磷酸和0.1%三乙胺）、甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾-冰醋酸（40∶60∶1）〔8〕等作为流动相，分别采用各文献中等度或梯度两种洗脱方式，发现盐酸小檗碱与干扰成分分离效果不理想或两目标成份出峰时间太长。经摸索，最终选择流动相为甲醇-0.2%磷酸（45∶55）时，盐酸小檗碱和黄芩苷在20 min内出峰，其他成分不干扰，分离度好，且节约实验成本。

〔1〕国家药典委员会.中国药典一部〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2010：814.

〔2〕袁汀，郝延军.高效液相色谱法测定明目上清片中黄芩苷含量〔J〕.山西医药杂志，2009，38（10）：963-964.

〔3〕柴金苗.高效液相色谱法测定明目上清片中橙皮苷的含量〔J〕.中国中医药信息杂志，2010，17（12）：43-44.

〔4〕胡春丽，王冬梅，张鹏，等.RP-HPLC法同时测定当归龙荟片中黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量〔J〕.药物分析杂志，2008，28（12）：2011-2014.

〔5〕梁盈军，舒洁倩.HPLC法测定黄连解毒汤传统汤剂与配方颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷含量的研究〔J〕.中国现代药物应用，2011，5（4）：14-15.

〔6〕胡茂华，钟玲，黄小玉，等.HPLC法同时测定蓝芩口服液中盐酸小檗碱与黄芩苷的含量〔J〕.重庆医科大学学报，2009，34（2）：210-211.

〔7〕张婷，周平兰.HPLC法测定复方芩柏颗粒中黄芩苷和盐酸小檗碱含量〔J〕.中药新药与临床药理，2009，20（4）：349-351.

〔8〕马群，艾路，刘勇，等.安宫牛黄丸中栀子苷、黄芩苷和盐酸小檗碱含量测定研究〔J〕.中国中药杂志，2009，34（20）：2647-2648.

（责任编辑 毛本勇）

Simultaneous Determination of Berberine Hydrochloride and Baicalin in Mingmushangqing Tablets by HPLC

ZHOU Ping,ZHOU Nong,ZHANG Haizhu
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of berberine hydrochloride and baicalin in Mingmushangqing tablets.Methods:HPLC was carried out with indexes of Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）,column temperature at 25°C,the mobile phase of methanol-0.2%phosphoric acid（55∶45）,flow rate at 1.0 mL·min-1,and detection wavelength at 265 nm.Results：The method showed good linear relationships within the range of 1.02-20.40μg·mL-1（r=0.999 9）for berberine hydrochloride and 4.54-90.80μg·mL-1（r=0.999 8）for baicalin, respectively.The average recoveries were 99.2%（Relative Standard Deviation RSD=1.1%）and 101.2%（RSD=1.6%）.Conclusion: The method described above is simple,accurate and reproducible which could be used for the quality control of Mingmushangqing tablets.

HPLC;Mingmushangqing tablets;berberine hydrochloride;baicalin

R917

A

1672-2345（2012）06-0012-04

2011-11-18

2012-03-27

周萍，教授，主要从事药物质量控制研究.