许锴 张德亭 郑加永 柳牡丹

[摘要] 目的 通过对乙型肝炎患者外周血单个核细胞及血浆中共价闭合环状DNA（cccDNA）的检测，初步探讨其外周血检测对乙型肝炎诊治的价值。 方法 将86例确诊为乙型肝炎患者根据病情分为3组，急性乙型肝炎(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)及HBsAg无症状携带者(ASC)组。采集外周血，分别检测ALT、AST、总胆红素（TBIL）、cccDNA、HBV-DNA。 结果 三组血浆cccDNA检测 结果有显著性差异（P＜0.01）。单个核细胞cccDNA 7个标本阳性，血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT 、AST 、TBIL相关系数分别为0.817、0.402、0.450、0.221。 结论 血浆cccDNA在乙型肝炎患者的各个病程有显著性差异，单个核细胞cccDNA储存池确实存在但浓度较低难以检测。血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT、AST相关，但与TBIL无明显相关。

[关键词] 乙型肝炎；HBV-DNA；共价闭合环状DNA

[中图分类号] R512.6+2[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）02-0064-03

Clinical apply of peripheral blood HBV cccDNA detection

XU Kai1 ZHANG Deting1 ZHENG Jiayong1 LIU Mudan2

1.Wenzhou Third People's Hospital in Zhejiang Province， Wenzhou 325000, China； 2.Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China

[Abstract] ObjectiveTodetectboth peripheral blood mononuclear and plasmacovalently closed circular DNA(cccDNA) of HBV patients, to investigate peripheral blood cccDNA value for HBVdiagnosis and treatment. MethodsDivided86 cases ofHBV patients into three groups, acute hepatitis B (AHB), chronic hepatitis B (CHB), HBsAg asymptomatic carriers (ASC) group. Peripheral blood was collected, we detectedALT, AST, TBIL, cccDNAand HBV-DNA, then analyzed the result with SPSS 11.0. Results With rank sum test, there were significant difference for cccDNA among three groups (P＜0.01). Seven samples was positive for peripheral blood mononuclear, plasma HBV-DNA and cccDNA, ALT, AST, TBIL correlation coefficients were 0.817, 0.402, 0.450, 0.221. The cccDNA in the plasma of all patients with hepatitis B disease were significantly different, mononuclear cells cccDNA storage pool does exist but it's low and difficult to detect. Conclusion Concentration ofplasma cccDNA is related with HBV-DNA, ALT, AST, but no significant correlation with TBIL.

[Key words] Hepatitis B； HBV-DNA；Covalently closed circular DNA

目前临床主要依靠血清学方法检测HBsAg来诊断乙型肝炎感染情况，同时通过HBV-DNA的检测反映病毒复制情况或水平，用于患者病情的监测以及抗病毒疗效。2008年，吴月平[1]等报道了乙型肝炎病毒感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA-共价闭合环状DNA(cccDNA)，它不与蛋白共价结合，是乙肝病毒基因组的复制中间体，是rcDNA(松弛环状DNA)基础上合成的产物，又是前基因组mRNA合成的模板，它是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标。目前cccDNA的检测多停留于科研阶段并未大规模应用于临床，且目前研究肝细胞中cccDNA的报道多见，但外周血特别是单个核细胞(PBMC)的报道较少见。有文献报道,乙型肝炎患者PBMC中存在乙型肝炎DNA及病毒复制中间产物RNA[2] ，但对于PBMC中是否含有cccDNA、是否有复制都存在争议，且临床意义并不明确[3,4]。本文就86例乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞和血浆中cccDNA的检测，探讨外周血HBV cccDNA检测的临床应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选取2009年1～9月本院住院的乙型肝炎患者86例，男46例，女40例；年龄16～77岁,平均（43.9±17.0）岁，其中慢性乙型肝炎（CHB）36例、急性乙型肝炎（AHB）20例、HBsAg无症状携带者（ASC）30例，诊断符合2000年病毒性肝炎防治方案Ⅲ及2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]。

1.2 标本来源

用真空管采集上述乙型肝炎患者静脉血5mL，2mL血液用EDTA-K2抗凝，3mL血液不用抗凝。不抗凝血分离血清，用于ALT 、AST 、TBIL检测；抗凝血离心分离血浆，用于血浆cccDNA与HBV-DNA检测；离心后的血细胞层加淋巴细胞分离液，提取单核细胞进行cccDNA检测。

1.3 实验方法

ALT、AST和TBIL在OLYMPUS 5400全自动生化分析仪上测定；HBV-DNA的实时荧光定量检测试剂购自上海科华生物有限公司；血浆cccDNA和单核细胞cccDNA的实时荧光定量检测试剂购自上海申友生物技术有限公司，在ABI 7500荧光定量PCR扩增仪检测。HBV-DNA的抽提使用经典的酚氯仿抽提法[6]。

1.4 统计学处理

使用SPSS软件，对三组结果的比较使用秩和检验，对于不同指标之间的数据使用秩相关分析。

2 结果

2．1急性乙型肝炎

急性乙型肝炎20例血浆cccDNA阳性18例，阳性率90%；慢性乙型肝炎36例，cccDNA阳性18例，阳性率50%；HBsAg无症状携带者组30例，没有cccDNA阳性病例，阳性率0。三组之间采用秩和检验，有显著性差异（P＜0.01）；cccDNA阳性的病例其浓度分布有明显分别；急性乙型肝炎组浓度明显高于慢性乙型肝炎（P＜0.01）。

2．2 单个核细胞cccDNA的检测

单个核细胞cccDNA的检测只有急性乙型肝炎组有7例阳性，且浓度明显低于外周血的含量。

2．3 血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相关

血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相关系数分别为0.817、0.402、0.450、0.221；乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与HBV-DNA的秩相关系数 Rs=0.817, P＜0.01，可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA与HBV-DNA水平存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与AST的秩相关系数Rs=0.450, P＜0.01，可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与AST存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与ALT的秩相关系数Rs=0.402, P＜0.01,可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与ALT存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与TBIL的秩相关系数Rs=0.221, Rs＜0.4，根据相关系数重测信度评价，R应达到0.4以上，可认为cccDNA水平与TBIL相关性无意义。

3 讨论

乙型肝炎病毒的复制是一种保守的机制，在转录后模板仍然完整。乙肝DNA的复制，cccDNA是前基因组mRNA合成的模板，转录前基因组RNA，逆转录产生负链DNA，再合成双链DNA，继而成熟为cccDNA，是一个连续的过程[7]。cccDNA的产生过程相当复杂，目前尚未对cccDNA的形成有明确的结论，但cccDNA作为乙肝DNA的复制模板是感染病程的关键因素，所以乙型肝炎治疗的关键因素是清除和抑制cccDNA。cccDNA的检测特别是外周血cccDNA在临床上具有重要作用，但相关资料不多。由于肝组织标本取材限制，直接cccDNA维持和清除机制进行研究受到严重阻碍，到目前为止体内cccDNA的浓度、运转和清除机制都还知之甚少。我们可以进行假设，转氨酶等酶类存在于肝细胞胞质和线粒体中，这些物质在肝细胞损伤时可以直接释放入血，同理细胞核内的ccDNA分子在肝细胞损伤时也应该可以释放到血液中，而且这种释放会随着肝损程度的增加而增加。对于同一个患者而言，在不同时间段内，其cccDNA水平应该也相应发生变化，对判断病情有意义。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测外周血中的cccDNA动态变化更具有现实意义。

本课题对86例乙型肝炎患者进行分组，使用实时荧光定量PCR法检测患者血浆中cccDNA。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、HBsAg无症状携带者三组之间cccDNA分布位置有差异；86例患者血浆cccDNA水平与ALT、AST存在正相关，而这两个指标可以代表肝功能损害。但患者血浆中cccDNA与血浆中TBIL并无相关性，可能因为TBIL升高是反应重度肝损的指标，当有大量肝细胞损伤坏死时TBIL才会升高，当肝细胞炎症和轻度损伤时其升高并不明显。因此，血浆检测出的cccDNA可以作为肝脏损害的标志，可以反映乙肝患者病情进展及程度，同时也反映了实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎患者血浆中HBV cccDNA灵敏度较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙肝患者血浆中cccDNA的水平及动态变化。

PBMC是体内免疫活性细胞的集合体，这些细胞在机体免疫应答中发挥重要作用。有研究表明[8]，HBV肝外的一个重要靶细胞就是PBMC，PBMC在乙肝免疫功能及病毒持续改变发挥特定的作用，在患者PBMC中检测出cccDNA，说明HBV可以感染PBMC。本文研究发现在乙型肝炎患者PBMC中cccDNA有7例阳性，占8.3%,说明HBV不但可以感染PBMC，而且可以在其中复制。但本实验PBMC中cccDNA检出率较低，且浓度均较低，与郑守虎[9]等报道的60%的阳性比率相差很大，可能为我们实验分组方式稀释了阳性比率，且我们本次实验采用ATP酶降解标本中的松弛环状DNA（rcDNA）,大大减少了HBV-DNA对cccDNA检测造成的影响。本实验验证了cccDNA复制的肝外储存池的存在，可以解释血浆cccDNA水平与ALT、AST相关系数较低的原因：肝细胞不是外周血cccDNA的唯一来源，PBMC也是外周血中cccDNA的另一来源。PBMC中cccDNA的检测可以在乙型肝炎患者抗病毒治疗的疗效判断中发挥重要作用，抗病毒药物能否杀灭PBMC中的cccDNA也是观察乙肝复发的重要指标。

本实验存在的问题是: 实验样本量较小； cccDNA敏感度低于HBV-DNA；乙型肝炎患者的ALT、AST易受降转氨酶药物治疗等原因的影响等。有待进一步增加样本数量及动态观察慢性乙型肝炎患者发病各期的cccDNA水平，以确定其水平与乙肝患者病情轻重、病情进展的关系。

[参考文献]

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[7]骆抗先.乙型肝炎基础和临床[M].第2版. 北京:人民卫生出版社，2001: 29-32.

[8]曹宸，陈映，吴忠均 . 慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能与单个核细胞乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的关系[J]. 中华传染病杂志，2011,29（4）：226-231.

[9]郑守虎，董庆鸣. 套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBV cccDNA[J]. 中国卫生检验杂志,2008，18（11）：2317-2318.

（收稿日期：2011-01-11）