孙佳明，李 娜，张艳平，宫 爽，贾雪婷，张 辉

(长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130021)

通顶散源于明代名医吴鹤皋所著《医方考》，方由藜芦、人参、川芎、细辛、石膏、甘草组成，主治“中风不省人事，病已极矣，非平药可以开其壅塞”，以藜芦与人参、细辛共用，取其相反而相用也。藜芦总生物碱具有明显而持久的降压作用，临床上多用于治疗脑卒中不语[1]。有报道[2]称人参与有毒藜芦配伍，有毒性降低的结果，因此有必要结合毒理学方法应用现代高效液相色谱-质谱联用技术，对“通顶散”中“人参-藜芦”相反相用的物质基础进行研究。

1 材料和方法

1.1 试验药物 藜芦、人参、川芎、细辛、石膏和甘草购自吉林省长春市吉林大药房；试验所用的通顶散和去人参样品水煎液由长春中医药大学研发中心提供。

1.2 仪器 Agilent 1100 series LC-MSD液质联用仪(美国安捷伦公司)，包括：Agilent SL型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)、自动进样、柱温箱、Chemistation化学工作站等；GL-20G-H型低温超速离心机；BP211D型十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.3 试剂 乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯(Fisher公司生产)；水为超纯水(Milli-Q)。

1.4 实验方法

1.4.1 通顶散及其去人参样品水煎液的制备 各自将藜芦1 g，人参1 g，川芎1 g，细辛1 g，石膏5 g，甘草1 g(均为粗粉)混合，首次加10倍量水浸泡20 min，微沸提取40 min,第2煎加入8倍量水，微沸提取20 min，合并2次滤液，浓缩，得到通顶散水煎液；将藜芦1 g，川芎1 g，细辛1 g，石膏5 g，甘草1 g(均为粗粉)混合，同法制得去人参样品水煎液，供急毒测试用。将以上制备的煎液静置，经10 000 r/min离心10 min，取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃保存，供液质分析用。

1.4.2 色谱质谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：甲醇/0.1%的甲酸水溶液二元线性梯度洗脱，流动相梯度设置(见表1)。流速：0.6 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

表1 高效液相色谱流动相梯度表

电喷雾离子源(ESI)；正、负离子同时采集；扫描范围：50～1 200 Da；目标分子量：500；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9.0 L/min；雾化气压强：0.24 MPa；毛细管电压：4 kV。

2 结果和讨论

2.1 通顶散及其去人参样品水煎液中化学成分的色谱研究 结果表明,甲醇0.1%的甲酸水溶液二元线性梯度洗脱，通顶散及其去人参样品水煎液中化学成分得到了较理想的分离效果。

2.2 通顶散及其去人参样品水煎液中化学成分的高效液相色谱与电喷雾质谱联用研究 采用HPLC-DAD-ESI-MS2联用技术,根据藜芦生物碱类化学成分的色谱保留时间、紫外吸收特征、准分子离子峰和二级质谱碎片信息，并参考文献[3-4]进行解析，鉴定了通顶散及其去人参样品水煎液中共有的9个藜芦生物碱类化学成分的可能结构。由于通顶散及其去人参样品水煎液中的每个对应色谱峰的保留时间、紫外吸收特征、准分子离子峰和二级质谱碎片信息均基本相同，因此每个色谱峰的峰面积的变化可以反映对应化合物含量的变化。对通顶散水煎液中各色谱峰的峰面积与去人参样品水煎液中对应的色谱峰的峰面积进行对比分析，发现通顶散水煎液中藜芦生物碱的种类和数量并未产生变化。但除了伪介芬胺和藜芦酰棋盘花胺的峰面积有所增加外，其余色谱峰的峰面积均有不同程度的减少，这说明通顶散中其他生物碱化学成分含量相对于去人参样品水煎液均有不同程度的下降。尤其是介芬胺的含量下降尤为明显，仅为去人参样品水煎液的26.2%，其他生物碱成分含量下降到去人参样品的34.4%～97.9%不等。通顶散及其去人参样品水煎液中9个共有成分的对应色谱峰的峰面积的变化和HPLC-DAD-ESI-MS2分析结果见表2。

表2 通顶散及其去人参样品水煎液中共有藜芦类生物碱成分正离子扫描模式的HPLC-DAD-ESI-MS2分析结果

3 讨论

通过通顶散及其去人参样品水煎液的毒性比较，前者的小鼠口服LD50明显高于后者，说明当通顶散中去掉人参仅余一个相反药对“细辛-藜芦”时，其毒性明显增强。结合液质联用分析发现二者所含藜芦生物碱类成分的种类和数量基本一致，但是通顶散中多数藜芦生物碱类化学成分含量相对于去人参样品水煎液均有不同程度的下降，尤其是介芬胺的含量下降尤为明显，说明通顶散的去人参样品产生毒性反应的物质基础系藜芦类生物碱。而且文献报道藜芦类生物碱多数具有强烈的毒性，例如芥芬胺给小鼠静注的LD50为9.3 mg/kg，为剧毒类生物碱。正是这些具有强烈毒性的藜芦类生物碱成分在通顶散中两个相反药对共用的情况下，减少成分溶出，又保留了一定的含量，从而起到了减小毒性，保证疗效的作用。本研究结果对通顶散的传统功效与“十八反”基础理论有机结合的现代科学内涵的研究有一定借鉴的意义。

[1]韩进庭.黎芦的药理作用与临床应用[J].现代医药卫生,2011,27(20):3186-3187.

[2]段玉华,李居林,纪淑芳,等.人参解毒作用的研究[J].吉林中医药,1986,6(5):30.

[3]李向荣.近10年来对中药十八反毒理及其物质基础的研究进展[J].环球中医药,2011,4(4):317-320.

[4]梁爱葵,于艳,杨洪武,等.藜芦与人参三七西洋参配伍后藜芦定的含量变化研究[J].辽宁中医杂志,2012,39(5):908-909.

[5]王宇光,王超,梁乾德,等.十八反中藜芦与人参配伍化学成分变化的UPLC/Q-TOFMS研究[J].中国科学(生命科学),2011,41(10):925-932.

[6]章斌,董昕,娄子洋.UHPLC-Q-TOF/MS对藜芦药材化学成分的快速分离与鉴别[J].第二军医大学学报,2012,33(5):536-539.