董建英赵会兰

（1云南丽江市人民医院，云南 丽江 674100；2云南丽江市食品药品检验所）

黄藤素片微生物限度检查方法验证研究

董建英1赵会兰2

（1云南丽江市人民医院，云南 丽江 674100；2云南丽江市食品药品检验所）

目的：建立黄藤素片微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2005年版的规定，进行该品种微生物限度检查方法的验证。结果：常规法试验显示黄藤素片对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均有抗菌作用，不同批产品其抗菌活性有差异，回收率小于70%；培养基稀释法可消除本品对上述4种菌株的抗菌作用，回收率大于70%；常规法试验和稀释法试验均有1批未检出大肠埃希菌；采用薄膜过滤法冲洗300或400 mL，检出大肠埃希菌。结论：本品不能用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌数测定，可采用稀释法进行测定；不能用常规法和稀释法进行控制菌检验，可采用薄膜过滤法进行检验。

黄藤素片；微生物限度；方法验证

黄藤素片是从防己科天仙藤植物黄藤中提取的生物碱精制而成。具有较强的杀灭金黄色葡萄球菌、抗酸性分枝杆菌的作用。临床上主要用于妇科炎症、菌痢、肠炎、呼吸道及泌尿道感染、外科感染等[1]，因此按常规法检验其微生物限度得到的结果不准确，根据《中国药典》2005年版的规定，必须采用方法学验证试验说明微生物限度检查法结果准确性和实验方法的可靠性[2]。本研究对黄藤素片微生物限度的检查方法进行了验证，结果显示黄藤素片对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，不同批产品抗菌活性有差异[3]。

1 材料

1.1 样品

黄藤素片，云南滇池制药有限公司生产（规格：100片/瓶、100 mg/片；批号：060901、070301、070101）。

1.2 培养基及稀释剂

营养琼脂（批号：061102），玫瑰红钠琼脂（批号：060221），胆盐乳糖（批号：070117），营养肉汤（批号：081104），麦康凯琼脂（批号：071225），改良马丁培养基（批号：060315），北京三药科技开发公司生产；4-甲基伞形酮葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）培养基（批号：060312），北京牛牛基因技术有限公司生产。无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH 7.0）

1.3 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44 102]、白色念珠菌 （Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]，均由云南省食品药品检验所提供。本实验所用大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌菌株为第3代，黑曲霉菌悬液为第2代。

2 方法

按照《中国药典》2005年版（一部）微生物限度检查法[4]附录进行。

2.1 菌液制备

2.1.1 取经 37℃培养 18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/mL的菌悬液，备用。

2.1.2 取经27℃ 培养18～24 h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液 10倍稀释至约含 50～100 cfu/mL的菌悬液，备用。

2.1.3 取1 mL黑曲霉孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/mL孢子悬液，备用。

2.2 供试液制备

称取样品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀，为1∶10供试液。

2.3 常规法验证试验

2.3.1 试验组取1∶10供试液1 mL和试验菌50～100 cfu，然后每皿加15～20 mL营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，37℃培养48～72 h计数，进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。

2.3.2 菌液组取试验菌50～100 cfu，然后每皿加15～20 mL营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，37℃培养48～72 h计数。

2.3.3 供试品对照组取1∶10供试液1 mL，然后每皿加15～20 mL营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，37℃培养48～72 h计数。

表1 常规法试验黄藤素片回收率结果

2.3.4 常规法试验结果表明，本品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌有抗菌作用，不同批产品其抗菌活性有差异，回收率小于70%，故不能采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。

2.4 培养基稀释法验证试验

2.4.1 取 1∶10供试液采用 1.0、0.5、0.2 mL/皿再加入试验菌50～100 cfu，方法同常规法进行试验，结果见表2～4。

表2 第1次试验黄藤素片回收率试验结果

表3 第2次试验黄藤素片回收率试验结果

表4 第3次试验黄藤素片回收率试验结果

2.4.2 培养基稀释法试验结果表明，培养基稀释法可消除本品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的抗菌作用，回收率大于70%，故可采用稀释法（0.2 mL/皿）进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。

2.5 常规法控制菌检查方法验证

2.5.1 试验组取1∶10供试液10 mL和大肠埃希菌50～100 cfu，加入到胆盐乳糖增菌培养基100 mL中，依据大肠埃希菌检查法进行试验。

2.5.2 阴性对照组取1∶10供试液10 mL和金黄色葡萄球菌50～100 cfu，加入到胆盐乳糖增菌培养基100 mL中，依据大肠埃希菌检查法进行试验，结果见表5。

表5 控制菌检查方法验证结果

2.5.3 常规法试验结果表明，有1批未检出大肠埃希菌，故不能用常规法进行控制菌检验。

2.6 稀释法控制菌检查方法验证

2.6.1 取1∶10供试液10 mL和大肠埃希菌50～100 cfu，分别加入到胆盐乳糖增菌培养基 100、200、300、400、500 mL中，依据大肠埃希菌检查法进行试验，结果见表6。

表6 稀释法控制菌检查方法验证结果

2.6.2 稀释法试验结果表明，有1批未能检出大肠埃希菌，故不能用稀释法进行控制菌检验。

2.7 薄膜过滤法控制菌检查方法验证

2.7.1 取1∶10供试液10 mL，注入开放式滤器（先用上述缓冲液润湿滤膜），再用上述缓冲液100 mL分别冲洗3次或4次，总量300或400 mL，抽干，分别加入胆盐乳糖增菌培养基100 mL和大肠埃希菌50～100 cfu，依据大肠埃希菌检查法进行试验。结果见表7。

表7 薄膜过滤法控制菌检查方法验证结果

2.7.2 薄膜过滤法试验结果表明，采用薄膜过滤法冲洗300或400 mL，检出大肠埃希菌，可采用薄膜过滤法进行控制菌检验。

3 讨论

3.1 微生物限度方法学验证是《中国药典》2005年版新增项目。按照其规定，当进行药品的微生物限度检查法时，应采用大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌 5株试验菌逐一进行回收率测定，以确认所采用的方法适合该药品的检验，验证试验应包括对细菌、霉菌和酵母菌及控制菌的验证。

3.2 黄藤素片对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均有不同程度的抗菌作用，说明了《中国药典》2005年版药典规定进行方法学验证实验是很必要的。

3.3 不同批号的黄藤素片用稀释法进行验证试验，其回收率试验结果显示，对大肠埃希菌的回收率差异较大，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的回收率无明显差异，不同批号的黄藤素片进行控制菌验证试验，对大肠埃希菌的抑制作用差异较大。可能与原药材质量和来源有关。3.4本品可采用稀释法（0.2 mL/皿）进行细菌、霉菌和酵母菌数测定；采用薄膜过滤法进行控制菌检验。

[1] 国家药典委员会.中国药典1977年版（一部）[S].北京：人民卫生出版社：523.

[2] 王德启.珍珠冰硼散微生物限度检查方法学验证[J].中国执业药师，2011，8（2）：37-39.

[3] 苏德模，马绪荣.药品微生学检验技术[M].北京：华龄出版社，2007：209-236.

[4] 国家药典委员会.中国药典2005年版（一部）[S].北京：化学工业出版社，附录：70.

The Research on the Method Validation of Microbial Limit Test for Huangtengsu Tablets

Dong Jianying1，Zhao Huilan2(1 The People’s Hospital of Lijiang City of Yunnan Province，Yunnan Lijiang 674100，China；2 Institute for Foods and Drug Control of Lijiang City)

Objective：To establish the method of microbial limit tests for Huangtengsu tablets.Methods：According to the 2005 edition of the Chinese Pharmacopoeia，the microbiological test methods on Huangtengsu tablets were validated.Results：By using the conventional test methods，the antibacterial actions of Huangtengsu tablets were showed for escherichia coli，staphylococcus aureus，bacillus subtilis，and candida albicans，of which the antimicrobial activity varied with different product batches，and the recovery rate was less than 70%.The culture medium dilution method could eliminate the antibacterial activity of the product for the above four strains and the recovery rate was greater than 70%.Both conventional test methods and dilution method failed to detect escherichia coli in one batch of the product，which was improved by membrane filtration flushing with 300 or 400 mL.Conclusion：For the product，the dilution method can be used for the tests of bacteria (and mould or yeast)counts and membrane filtration can be used for bacteria detection rather than the conventional test methods.

Huangtengsu Tablets；Microbial Limits；Method Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.05.008

2011-09-21）

董建英，女，副主任药师。研究方向：医院药学。E-mail：1327181629@qq.com赵会兰，女，副主任药师。研究方向：药品检验。通讯作者E-mail：1145472590@qq.com