徐晓云，李冬斌，李 彬

(1河北医科大学第二医院，石家庄050000;2河北医科大学)

核转录子κB(NF-κB)在炎症性肠病(IBD)的发生发展过程中是一种重要的转录因子。2007年3月～2008年12月，本研究通过合成NF-κB decoy寡核苷酸(ODNs)并转染，对LPS诱导结肠癌SW480细胞NF-κB的活化进行干预，用TransAMTM法测定了细胞核NF-κB p65的DNA结合活性，观察其对结肠癌细胞NF-κB DNA结合活性的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料和试剂 结肠癌SW480细胞株购自上海麦莎生物科技有限公司，大肠杆菌(E.colioll:B4)购自Sigma公司。Trizol试剂以及阳离子Lipofectamine2000脂质体购自美国 Invitrogen公司。RPMI1640购自美国Gibco公司，BCA-Protein Assay kit购自晶美生物工程有限公司，TransAM NF-κB p65 kit购自晶美生物工程有限公司，兔抗人NF-кB p65单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 ODNs 序列设计 参考文献［1，2］设计 ODNs 序列，由上海博亚生物技术有限公司合成。NF-κB decoy ODNs:5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'和3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5';Scrambled decoy ODNs:5'-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-3'和3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5'。

1.3 细胞培养 SW480细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。培养液含10%热灭活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基。

1.4 细胞转染 每次转染前退火，将互补的两条单链ODNs合成双链ODNs(ds-ODNs):将等摩尔的互补单链脱氧ODNs混合，98℃水浴5 min，缓慢降至室温，形成 ds-ODNs，－20℃保存。根据 Lipofectamine2000试剂盒说明书处理 ds-ODNs。细胞随机分为5组。对照组:不作处理;脂多糖(LPS)组:LPS(10μg/L)刺激3 h;NODN组:LPS(10μg/L)刺激3 h后转染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs 6 h;SODN组:LPS(10μg/L)刺激3 h后转染1μmol/L的Scrambled ODNs 6 h;Lipofectamine2000组:LPS(10μg/L)刺激 3 h后加入同等剂量 Lipofectamine2000 6 h。

1.5 细胞核蛋白的提取［3］常规培养SW480细胞，移去细胞培养液，用冷PBS洗细胞2次，转入预冷的2 mL离心管，细胞再用PBS洗1次，3 000 r/min离心3 min，弃去PBS，打散细胞，－80℃冷冻5 min，以200μL缓冲液A重悬细胞，加0.2 mmol/L的PMSF，加Leupeptin至终浓度10μg/mL，吹打细胞，冰上放置2 min。加20μL的1%NP-40，旋涡振荡10 s，5 000 r/min离心30 s，吸上清，沉淀物重悬在50μL预冷缓冲液C中，加10μg/mL的Leupeptin、0.5 mmol/L 的 PMSF，4 ℃振摇15 min，13 000 r/min离心5min，吸上清后移至新的1.5 mL管中，－70℃保存。……