江清林,李 莹,刘金英,辛 华,朱晓峰

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

长期以来,人们普遍认为哺乳动物中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞,缺乏再生能力,神经细胞的产生仅限于胚胎时期和出生后的短暂时期,以后神经元的分裂即告结束,这意味着成年哺乳动物脑内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更新或替代。然而,1992年 Reynolds等和 Richards等先后从成年鼠的纹状体和海马中分离出 NSC,彻底打破了成体哺乳动物神经细胞不能再生的传统观念。现在,人们已经从胎鼠[1]、胎儿[2]、成年鼠[3]、和成人脑[4]的皮层、室管膜下区、纹状体、海马、中脑等脑区分离得到了神经干细胞。神经干细胞不仅可以作为研究神经发育的模型,并且,作为潜在的移植细胞的来源,为临床治疗神经系统疾病提供了一个新的有效治疗途径[5]。因此,神经干细胞研究成为本世纪神经生物学领域的热门。本文就神经干细胞的研究情况进行介绍。

1 神经干细胞的概念及基本生物学特征

1.1 神经干细胞的概念

神经干细胞是一种具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞,它处于未分化状态,可通过对称或不对称分裂方式分裂增殖,最终分化成中枢神经系统的三种主要细胞,即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞的特征性生物学标志物为神经上皮巢蛋白(Nestin),随着神经上皮的分化成熟而逐渐消失,其功能目前尚未完全明确。

1.2 神经干细胞的生物学特性

1.2.1 自我更新

神经干细胞具有高度增殖和自我更新能力,在一定条件下能不断进行有丝分裂。其分裂方式主要有两种,一种是对称分裂,此种分裂方式产生的两个子细胞都是干细胞;另一种是不对称分裂,分裂产生一个干细胞和一个子代分化细胞,后者最终分化成为终末细胞。神经干细胞通过分裂进行增殖,细胞互相聚集形成神经球,神经球内含有神经干细胞,神经前体细胞,凋亡细胞和已分化的神经元和神经胶质细胞,具体成分根据具体培养情况不同而不同。神经球经过机械分离后可继续增殖,并形成子代神经球。传代后的神经干细胞与母代干细胞的生物特性完全相同。张晓梅等[6]报道,神经干细胞可在体外传代达3年以上。

1.2.2 多潜能分化

神经干细胞在特定条件下可以分化形成神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞等,其分化与局部微环境密切相关,目前可通过生长因子诱导,基因调控及信号传导通路调节等途径诱导神经干细胞的分化,为进一步获取治疗疾病所需要的细胞类型奠定了基础。

1.2.3 迁移功能和良好的组织融合性

在人类和哺乳动物神经系统的发育过程中,神经干细胞沿着发育索方向迁移。移植后的神经干细胞则受病变部位神经源性信号的影响,向病变部位迁移,并分化成特异性神经细胞,与宿主细胞形成初步良好结合,参与宿主神经网络,形成神经网络整合,促进正常脑功能的恢复。

1.2.4 处于高度未分化状态

神经干细胞呈巢蛋白(nestin)阳性,但缺乏已分化细胞的抗原标志,无成熟细胞相应的特异性标志,处于原始的未分化状态。

2 神经干细胞的分布

神经干细胞主要存在于胚胎鼠的纹状体、小脑半球、脑室区等。1992年,Reynolds等在成年鼠的纹状体也发现了神经干细胞。Morrison等利用细胞表面标记和流式细胞仪检测,发现从哺乳动物胚胎神经管嵴能够分离出神经干细胞。经过人们的研究发现,在一些过去曾认为不可能存在神经细胞再生的区域,如脊髓、隔区也分离出了神经干细胞。1996年,Weiss等还证明了成年哺乳动物的脊髓中央管附近的室管膜细胞具有神经干细胞的特征。近年来的研究证明,成年哺乳动物中枢神经系统中广泛存在着神经干细胞,且在成年哺乳动物脑内有两个能终生产生神经元而且增殖活跃的两个区域,是前脑室下带(subventricular zone,SV Z)和海马齿状回的亚颗粒带(vsubgranularzone,SGZ)。

3 神经干细胞的分离培养

神经干细胞的体外培养已经较成熟,目前主要采取的是悬浮培养方式,该方式下培养的神经干细胞以神经球的形式生长和增殖。多数研究认为从脑中培养神经干细胞需要bFGF和 EGF的存在,在体外培养的培养液中加入 bFGF或EGF,神经干细胞可保持非常稳定的功能和更新能力。但尽管 EGF和 bFGF都能够促进神经干细胞的增殖和分化,但这两种因子不可以互换使用或只使用一种,因为在 EGF单独存在的情况下,主要形成胶质细胞,而多数情况下 bFGF可引起最大程度的神经细胞发生。将从动物体中直接分离出的神经干细胞培养至含 B27,bFGF,EGF等因子的培养基中进行培养,可保持神经干细胞的稳定生长。获得神经干细胞的方法不只是直接从动物体中分离,还可通过其他方法,例如定向诱导骨髓基质细胞(MSCs)向神经干细胞的转化。已有一系列的研究证实,骨髓基质细胞移植入啮齿类动物的脑内后 ,可以分化为神经元和星形胶质细胞[7～10]。对这部分的研究国内外进行的都比较多,Woodbery等首次在体外诱导骨髓基质细胞横向分化为神经元[11],国内有张卉等报道,解剖出 Wistar大鼠股骨,取出骨髓细胞 ,用培养液(B27培养液 ,DM EM/F12,3:1,5μ g/mL胰岛素 ,100 μg/mL入转铁蛋白,肝素,100 μg/mL腐胺,30nmol/mL亚硒酸钠,5mg/mL葡萄糖 ,0.1%青霉素和链霉素,2.5μg/mL二性霉素 B,10%胎牛血清)调整细胞浓度至1×105个 /mL,接种至培养板中,37℃,5%CO2,95%空气,饱和湿度的培养箱中培养。培养第3天进行细胞传代,以后每3天换液一次,清除大部分杂质细胞。若撤去 EGF、bFGF加入 BDNF、胶质细胞条件培养液继续培养,细胞可分化为神经元和星形胶质细胞[12,13]。

由于原代培养的神经干细胞在体外长期培养过程中,很难维持稳定不变的生存或增殖状态,因此,为了保持神经干细胞在体外长时间生存、分裂和增殖,目前应用基因转移技术得到了永生化的神经干细胞系,即诱导神经干细胞的细胞周期不断循环,达到阻止细胞分化的目的,用于基因转移和神经再生方面的研究。最常用的方法是通过逆转录病毒载体将编码癌基因蛋白的基因转导入胚胎神经干细胞中,使细胞停留在分化过程的某一个阶段,不能进行终末分化,并获得长期传代的能力[14]。Slinskey等利用 large T抗原的突变等位基因,即癌变的 tsA58温度敏感性基因具有的良好性能,即在体外培养温度 (33℃)条件下非常稳定,而在体内温度(37～39℃)条件下会降解这一特性,应用 SV 40的病毒质粒载体将 large T抗原导入胚鼠来源的神经干细胞中,发现每一个表达 large T抗原的细胞系,既可以在不含 EGF的培养基中进行分裂,又能够在含10%FBS的培养基中生长增殖而不发生分化,还可以有效地抵抗凋亡的发生,尤其是其温度敏感性,避免了移植入体内使机体癌变的可能,因此可作为条件永生化神经干细胞系。神经干细胞系有以下生物学特性:①能够自我更新,自我复制并在体外大量增殖的细胞。②移植入体内后仍具有多分化潜能。③可被转染并稳定地表达外源性基因(报告基因和治疗基因)④可分离出单细胞克隆[15]。因此,其可作为脑内神经细胞移植及作为基因转移的工具。但同时细胞系的基因表型和蛋白表达与正常细胞有着显著的不同,这应当引起研究者的注意。

4 神经干细胞的分化微环境调控

影响神经干细胞的分化的因素有很多,主要包括内源性因素(基因)和外源性因素的相互作用调控。其中 ,内源性因素起决定性作用,外源性因素是必要条件,两者关系非常复杂。

4.1 微环境的调控

4.1.1 生长因子

目前,对神经干细胞的增殖和分化有影响作用的生长因子主要有表皮生长因子 (EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)两种。EGF在发育脑和成年脑中均有表达 ,在发育较晚期促进神经前体细胞的增殖和分化。有证据表明,EGF对胶质前体细胞有促进增殖的作用,能够促进神经干细胞向胶质前体细胞分化,并可促进体外培养的神经元等多种神经细胞的生存和生长。FGF主要包括 FGF-1和 FGF-2等 ,其通过激活 FGF受体而起作用,在胚胎发育早期对维持神经前体细胞的生存和促进增殖起作用。有文章报道,胚胎大鼠皮质神经干细胞的增殖和分化呈 bFGF浓度依赖性,低浓度时有利于向神经元方向分化,高浓度时有利于向少突胶质细胞方向分化,若加入其他因子如胶质细胞成熟因子和内皮素等,则神经干细胞可分化成星形胶质细胞。FGF-2还对具有多分化潜能的神经干细胞具有促进增殖的作用。

除 EGF和 FGF外,神经干细胞的分化还受其他生长因子的调控,如胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ ,IGF-Ⅱ )[16]能调节细胞存活、生长、分化、突触功能和神经递质的释放。血小板源性生长因子(PDGF)可能通过提高神经元方向分化的祖细胞的生存率,使得大鼠 NSC产生更多的神经元,但在人胚中则完全相反。

4.1.2 细胞因子

对神经干细胞的增殖和分化有影响作用的细胞因子有许多种,主要包括睫状神经营养因子(CN F)和白血病抑制因子(LIF)等。有报道称,CN F可特异性地诱导神经干细胞分化为神经胶质细胞。也有报道显示,CNF若作用于具有多分化潜能的神经干细胞,则促进其向胆碱能神经元分化,若作用于少突胶质细胞2型星形祖细胞则可诱导其分化为2型星形胶质细胞。而 LIF则可促进大鼠晚期的胚胎神经干细胞向星形胶质细胞分化,且能够刺激形成干细胞群落但对人胚的神经干细胞分化起抑制作用。

4.1.3 神经营养因子

神经营养因子的主要作用时促进神经元的存活及分化,不同的因子对神经细胞的分化有不同的调节作用。目前研究比较多的有脑源性神经营养因子(BDN F)、神经生长因子(NGF)和神经营养因子3(NT3)。

BDNF对各种神经元早期的发育、分化和生长再生具有维持和促进作用。有实验表明,神经球在外源性 BDNF存在的情况下,生长情况更加好。BDN F和血清联合作用时可诱导神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞,且分化为神经元的比例较单独用血清诱导要高。NGF广泛存在于动物体内,主要集中于大脑皮质、海马、隔核以及 Meynert核区。发育期 N GF受体在神经元上有广泛的分布。经研究证实,N GF有促进胚胎发育期神经干细胞分化为具有特异功能的神经元且对神经元的特异性功能具有维持作用,可促进发育神经元的生长。对于 N T3的研究,目前只知道其可使神经干细胞的增殖减少 ,促进其分化,但分化的方向目前未见报道。虽然神经营养因子对神经干细胞的分化有一定的影响,但其对分化的影响似乎是通过促进已分化的神经干细胞更加成熟,而不是促进未分化的多潜能神经干细胞定向分化。

5 神经干细胞的应用

5.1 神经干细胞原位诱导

国内外大量实验已经证实,成年脑中存在神经干细胞,如果在中枢神经受损伤时能够激活内源性神经干细胞,诱导其增殖且迁移至受损部位补充损失脑细胞,就可治疗中枢神经系统的疾病。现已有实验证实[17],在脑室管膜下区等部位的神经干细胞在脑损伤发生后确实能够增殖并迁移到受损部位,分化成新的神经细胞,取代损失的脑细胞。但实际上在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经细胞远远不能弥补损伤后脱失的神经组织,分析原因,可能是因为要原位诱导出功能特异的神经元需要多种刺激和特定细胞因子的作用。除了直接替代丢失的神经元外,还可以诱导植入的神经干细胞生成髓鞘形成细胞或星形胶质细胞,为损伤区神经元提供支持。

5.2 基因治疗

基因治疗是通过特定载体将相关外源基因导入体内,使其得到表达,达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。由于神经干细胞容易获取和增殖,有迁移能力,可整合于宿主细胞且有修复功能,使其成为基因治疗的最佳载体。而且,如果利用自身干细胞进行移植,还可避免发生免疫排斥反应。神经干细胞的基因可操作性及可携带多个外源基因的特性,使我们可以通过转基因技术,将外源性基因片段导入神经干细胞中,通过移植,使外源性基因得以在体内表达,达到治愈疾病的目的。但需要注意的是,若用永生化神经干细胞作为载体,移植后有致癌的危险。

5.3 神经干细胞的移植治疗

研究已经证实成年脑内存在神经干细胞,且脑损伤后内源性神经干细胞可自行增殖并迁移至受损伤区域进行修复,但实际上在大多数情况下,单靠内源性干细胞的修复来治疗神经系统的损伤在现阶段还是无法达到的,因为内源性干细胞产生的神经细胞在数目上远远少于受损伤和脱失的细胞。如果能够通过将外源性的神经干细胞移植入受损部位,使其替代因疾病死亡的神经干细胞,并与宿主神经系统整合,发挥神经系统功能,则可达到治愈疾病的目的。这引起了神经科学家的兴趣,通过大量的实验研究证明,神经替代和部分修复神经回路是可能的。

神经干细胞的移植治疗的效果很大程度上取决于植入神经干细胞在结构和功能上与宿主神经系统的整合程度,神经元在未有广泛轴突连接时移植到脑内生长良好,这与宿主脑年龄也有关系,胚胎时期整合最好,在出生后逐渐下降。研究表明,神经干细胞移植后,在局部微环境的作用下分化成相应的细胞来补充替代受损的细胞,恢复中枢神经系统的正常结构和功能,移植后产生的细胞也可以自主释放神经递质,产生神经营养因子和神经保护因子,从而控制神经变性或促进神经细胞的再生。虽然有关神经干细胞生物学的研究已经证明干细胞移植的可行性,但移植到体内的神经干细胞更多的是分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞[18,19],分化为神经元的很少。

5.3.1 帕金森病

帕金森氏病(PD)是因位于中脑部位“黑质”中的多巴胺能神经元发生病理性改变后,多巴胺的合成减少,抑制乙酰胆碱的功能降低,则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了“震颤麻痹”。

目前临床治疗 PD主要药物是 L-DOPA,但其只对发病初期5～10年有效,随着病情的严重,药量增加而导致副作用越来越重。同时,在目前的研究状况下,变性的多巴胺能神经元定位明确,纹状体-黑质的解剖位置清楚,且已有比较稳定的动物模型,因此,利用神经干细胞移植治疗 PD是非常适合的。

在动物实验中,向 PD模型大鼠纹状体植入合适数目的神经干细胞,发现植入细胞可长出神经纤维且不易产生免疫排斥反应,但体内 TH阳性细胞却很少,说明移植的神经干细胞不能自动分化为多巴胺能神经元,需要宿主信号的调节。已有研究表明,甲状腺激素 /维甲酸核受体超家族的转录因子 Nurrl是中脑多巴胺能神经元的分化诱导所必需的,同时还需要星形胶质细胞提供向多巴胺能神经元分化的信号。研究发现,将 Nurrl转染给神经干细胞系 C17.2并与胎鼠(E16)中脑腹侧原代神经元共培养时,TH表达明显。这便为临床应用细胞移植治疗 PD奠定了基础。现在,临床已有 PD患者进行了胚胎细胞移植,Preed研究显示,把人胚多巴胺能神经元移植入 PD病人脑内,可显著改善60岁以下病人的临床症状,但对60岁以上病人的症状未见改善,这有待于我们进行进一步的实验研究。

5.3.2 亨廷顿病

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病,致病基因位于4号染色体,被成为 Hunringtin基因,该基因的表达产物直接损伤携带该基因的神经元,并且通过长期的慢性损害过程波及其他神经元,以皮层和新纹状体最为严重。目前,亨廷顿病大鼠模型已经建立,将神经干细胞移植入其脑内,观察发现能够保护维持运动习惯的能力,能够恢复受损的运动习性,说明植入的神经干细胞已经在体内形成了功能性连接。而将胎儿纹状体细胞移植入喹啉酸损伤大鼠模型的纹状体内,12周后植入块有神经纤维长出并爬伸到宿主脑灰质内。因此,干细胞移植治疗亨廷顿病是有实验依据的,将其应用于临床指日可待。

5.3.3 脊髓损伤

对于脊髓损伤的治疗,人们也设想能用神经干细胞的移植来治疗。有实验表明,将人的神经干细胞移植入脊髓严重受损的大鼠模型,部分瘫痪的实验鼠在接受移植治疗后,可依靠后肢爬行,而且后肢运动比较协调。对实验鼠的解剖显示,神经干细胞在其体内分化成了少突胶质细胞和新的神经元细胞。其中新生的神经元细胞提高了实验鼠受损的神经元之间的“通信联系”,而少突胶质细胞分泌髓磷脂,髓磷脂是神经纤维表面的髓鞘的组成物质,髓鞘可以保护神经细胞,同时还能够加速神经信号的传导。虽然干细胞移植治疗脊髓损伤的研究有了一定进展,但需要注意的是脊髓神经元有着较长的突起,植入的神经干细胞能够参与这样的神经回路以及参与程度都有待进一步的实验研究。

目前,神经干细胞的移植还应用在缺血性中风,心脏骤停或冠状动脉阻塞造成的大脑血流中断而使某些易感神经元如海马 CAI椎体细胞死亡 ,经实验证实,可利用神经干细胞移植,使其与宿主神经系统建立连接,优先迁移到缺血区分化成机体所需要的神经细胞。同时,神经干细胞的移植还被应用于改善动物的认知功能等其他许多方面。

6 展望

虽然目前我们对神经干细胞的基本了解已经有了巨大提高,在治疗中枢神经系统疾病的动物模型实验上取得了一定的进展,但是我们必需清醒地认识到,我们关于干细胞所有的研究都仍然存在于理论层面,目前尚未发现某种物质可以明显提高神经干细胞向神经元分化的比例,且培养液中添加的刺激因子是否在促进细胞增殖的同时使其丧失了凋亡能力而导致肿瘤的产生也是我们所未知的。因此,要将神经干细胞真正应用于治疗神经系统疾病还需要相当长的时间,还有大量的未知在等待我们去研究发现,可谓任重而道远。

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