付永平，宋 冰,2，王丕武,*，卢 实

(1.吉林农业大学农学院，吉林 长春 130118；2.吉林市农业科学院，吉林 吉林 130118)

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

付永平1，宋 冰1,2，王丕武1,*，卢 实1

(1.吉林农业大学农学院，吉林 长春 130118；2.吉林市农业科学院，吉林 吉林 130118)

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因；将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游，得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ；利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中，通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定，得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子，对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测，得到一条约为81kD的目的蛋白条带；利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定，结果表明，酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明：cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达，并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别，并将表达产物分泌至胞外。

绿色木霉；纤维素酶；cbhⅡ基因；粟酒裂殖酵母；酶活力

纤维素酶作为一种重要的工业用酶，已经应用于食品、酿造、饲料等生产中，具有巨大的市场潜力。绿色木霉(Trichoderma viride)是产纤维素酶活性较高的菌种，能产生3类纤维素酶，所产生的纤维素酶能分泌到菌体外[1]。纤维二糖水解酶(1,4-β-D-glucancellobilhydrolase，CBH)是绿色木霉主要的纤维素酶，包括CBHI和CBHⅡ两种异构酶，可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素，CBHⅡ所占比例比CBHI少，但活力高，降解微晶纤维素产生还原糖的能力比CBHI高2倍[2]。……