液相色谱-质谱联用技术在药物分析中的应用*

2012-02-15戴冬艳朱静毅闻琍毓

天津药学 2012年3期

戴冬艳，朱静毅，闻琍毓

(江苏省扬州药品检验所，扬州 225009)

高效液相色谱(HPLC)是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因此应用范围广。近年来高效液相色谱法在药物分析中占主要地位，据《美国药典》22版记载，HPLC在含量测定方法中位居第一。

质谱(MS)是强有力的结构解析工具，能够为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱法是质量分离的质谱检测技术，在单级质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量［1］。串联质谱具有更高的选择性和灵敏度，其检测水平可以达到pg级。

液相色谱－质谱/串联质谱联用(LC－MS/MS)技术将液相高效的在线分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力相结合，可以同时得到化合物的保留时间、分子量及特征结构碎片等丰富的信息，是组分复杂样品和微量样品分离分析最有力的研究手段。与气相色谱－质谱联用(GC－MS)相比，GC－MS法对挥发性未知成分与微量成分的结构分析具有独到之处，但是GC－MS法的应用范围有限，因为所研究的药物样品必须气化，故难以用于极性、热不稳定和大分子化合物的测定。LC－MS不受上述限制，且分析前样品预处理简单，一般无需衍生化或水解，这使得LC－MS联用技术具有更广阔的应用前景。近年来，LC－MS联用技术应用越来越广泛，在药物及其代谢产物的定性和定量研究中发挥了极其重要的作用，本文综述了近年来LC－MS联用技术在药物分析中的应用。

1 液质联用仪器

液质联用仪主要由液相色谱仪、质谱仪、离子源组成。离子源即“接口”技术，就是将高流量的液相色谱和高真空的质谱体系进行“联用”，将欲分析的样品电离，得到带有样品信息的离子，使其进入质谱的真空系统，这一度曾是液质联用技术发展的“瓶颈”。一直到电喷雾技术和大气压化学电离技术的完善成熟，液质联用技术才得到快速的发展。当前使用广泛的接口技术有:热喷雾(TSP)、等离子体喷雾(PSP)、粒子束(LINC)、大气压电离(API)和动态快原子轰击(FAB)［2］。API主要包括电喷雾离子化(ESI)、离子喷雾离子化(ISI)和大气压化学离子化(APCI)3种模式。这3种的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性。质谱分析器是液质联用的核心，是确保仪器具有高灵敏性、高准确性、高选择性、分析检测范围宽等强大功能的重要部分。液质联用仪中常用的质谱包括串联四级杆、离子阱、四级杆－飞行时间质谱等。这些质谱各有特点，结合同位素标记等技术，在药物分析领域发挥重要作用。

2 在药物成分分析中的应用

LC－MS不仅具有足够的灵敏度选择性，同时还能够给出一定的结构信息，分析快速而且方便，为药物鉴定提供了一种更高效、更有效的方法。

2.1 天然药物成分分析中药药物成分复杂多样，定性分析方剂成分是一项复杂且耗时的工作。液质联用技术在对中药成分分析时，液相色谱对各成分进行在线分离，质谱检测器可以给出大量的结构信息，可对未知成分进行直接分析;且样品不需要进行烦琐和复杂的处理，因此在中药成分分析中得到广泛应用。

侯鹏飞等［3］采用液质联用(HPLC－ESI－TOF/MS)技术分析了延胡索中的生物碱类成分，以ESI－MS获得的准分子离子峰确定化合物分子量，结合紫外光谱、HPLC的保留时间等信息鉴定了延胡索中的11个生物碱类成分。薛长晖［4］采用液质联用法对山西苦荞中的黄酮类化合物进行分离鉴定，发现山西灵丘地区产的苦荞提取液中黄酮类化合物以芦丁为主，并分离出5种黄酮类化合物。

2.2 抗生素成分分析许多抗生素品种由于其产生菌绝大多数都是产生结构相似的多组分复合物，用常规分析方法对其进行快速鉴别和相关物质分析比较困难，药品质量难以控制。液质联用技术以其强有力的分离和分析能力，在这类抗生素药物成分分析和相关物质的鉴定上显示了巨大优势。

马凤余等［5］应用高效液相色谱－串联质谱技术快速鉴定头孢地嗪中异构体杂质的方法。在所建立的色谱条件下，头孢地嗪及其异构体杂质获得有效分离，并通过串联ESI质谱在线检测，获得相关的色谱和质谱信息，结果鉴定出头孢地嗪热降解的异构体杂质为反式异构体及Δ3异构体。Min Hu等［6］应用LC－MS技术鉴定了十六环大环内酯抗生素。

2.3 中成药、保健品、食品中非法添加化学药物成分的鉴定分析近年来，一些不法商人为牟取暴利，在中成药、保健品和食品中非法添加化学药物，患者在不知情的情况下大量服用，可能造成严重的不良反应，严重威胁到人类健康。液质联用技术以其灵敏度高的优点，越来越多地应用到非法添加药物成分的鉴别中，成为打假治劣的一把利剑。

2.3.1 中药制剂中非法添加化学药物成分目前中药制剂中非法掺入化学药物成分且同时掺入多种低浓度化合物是新动态之一。抗风湿类中药多数显效慢，需长期服用，但安全性高;西药非甾体抗炎药中绝大多数兼有抗风湿作用，此外糖皮质激素类亦具有抗风湿及类风湿作用。这些西药的共同特点是疗效迅速，但长期服用副作用大，严重的可危及患者生命。采用液质联用技术，结合相对分子量一级二级质谱碎片，可准确快速地判断中药制剂中是否掺入阿司匹林、氨基比林、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛这些西药［7］。来国防等［8］采用液质联用法检测补肾壮阳类中药制剂中非法添加的化学成分西地那非和他迭拉非，此法灵敏准确，可用于补肾壮阳类中药制剂的质量检验。伴随人们饮食习惯的改变，糖尿病的发病率呈上升趋势，因此降糖类中药制剂需求日益增大。但一些不法分子擅自在中成药中掺入化学降糖药，对患者的健康及生命安全造成了重大危害。李晓燕等［9］应用液质联用技术建立了降糖类中成药中非法添加降糖化学成分的快速定性方法，此法能同时鉴别降糖中药中是否添加盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列吡嗪、盐酸吡格列酮、格列齐特、格列本脲、格列美脲7种化学药品。

2.3.2 保健食品中非法添加化学药物成分近年来，随着生活水平的提高，保健品进入到更多的家庭中去。但是不法分子为了突显疗效，在保健品中加入化学成分的现象非常普遍。崔福春等［10］应用 LCMS/MS法建立了安神类保健品中非法添加21种化学成分的快速测定方法，该方法采用多反应监测的方式检测，干扰少，灵敏度高，检测结果更准确。闫韶华［11］应用液质联用仪建立了保健食品中非法添加药物——茶碱成分定性定量的方法，该方法可用于保健食品中非法添加药品茶碱成分的测定和确定。关日晴等［12］应用液质联用技术建立了保健品中非法添加的6种肾上腺皮质激素的检验方法，该方法可同时对《中国药典》收载的醋酸地塞米松、醋酸可的松、醋酸氢化可的松、醋酸泼尼松、醋酸泼尼松龙和倍他米松6种常用口服肾上腺皮质激素进行检查，准确率达到100%。

2.3.3 食品中非法添加化学药物成分河南省部分地区“瘦肉精”事件曝光后，引起国家各级部门高度重视，也使广大人民群众对食品安全的问题极为关注。引起人体中毒的“瘦肉精”主要是β－肾上腺素兴奋剂中的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。王秀颖等［13］建立了高效液相色谱－串联质谱同时检测猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇残留的方法，本法能快速、高灵敏、同步检测出这3种化学成分。液质联用对于检测禁用和限用的食品添加剂具有显著优势，还可以大大提高工作效率，能满足食品卫生学评价的要求，具有较强的实用价值。

3 在药物含量测定中的应用

药物含量测定是药物分析中主要的一个方面，液质联用技术对于成分复杂、微量药物定量具有优势，因此在中药含量测定和药物残留测定时应用广泛。

3.1 在药物成分含量测定中的应用严志宏等［14］采用LC－MS/MS法，建立了金樱子中熊果酸和齐墩果酸的含量测定方法。该法测定的熊果酸和齐墩果酸的平均加样回收率分别为98.1%(RSD为2.7%)和97.6%(RSD 为2.9%)，方法快速简便，灵敏度高，重现性好，可用于金樱子的质量控制。中成药附子理中丸具有温和健脾等功能，但其有效成分双酯型生物碱毒性很强，因此对含有附子的药品中双酯型生物碱的检测和控制就非常重要。索志荣等［15］采用LC－MS测定附子理中丸中3种双酯型生物碱——新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的含量，结果新乌头碱、乌头碱和次乌头碱平均回收率分别为98.7%(RSD为2.9%)、98.6%(RSD 为3.0%)和 98.1%(RSD 为 3.2%)，为评价和控制附子理中丸的质量提供了科学依据。

3.2 在药物残留测定上的应用液质联用技术出现以前，残留药物由于其含量低，检测方法落后，因此没有引起人们的重视。液质联用技术具有选择性好、灵敏度高等优点，是微量和痕量成分检测很有效的方法，被广泛应用于药物残留的测定上。于慧娟等［16］采用HPLC/MS/MS建立了分析鱼体中氯丙嗪残留的方法，适合于鱼类样品中氯丙嗪的残留检测。田艳玲等［17］采用液相色谱－串联三重四级杆质谱法测定牛奶中的氯霉素残留量。程朴［18］经过试验，建立了一种灵敏度高、结果可靠性高的液相色谱质谱联用分析法测定马铃薯样品中的喔草酯残留量。该方法残留测定最小检出量为2×10－8g，符合一般农药残留分析要求。液质联用技术由于其自身特点，在药物残留检测上具有广阔的前景，对于控制食品、药品质量意义重大。

4 在药代动力学、药物代谢学中的应用

液质联用技术在分析药物及其在各种复杂生物体基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中的代谢产物时，由于其选择性强、灵敏度高，不仅可以避免复杂、烦琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离、鉴定难于辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱的应用，通过多反应检测(MRM)，可以提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度，从而快速方便地解决问题。

4.1 在药代动力学研究中的应用人体(或动物)在接受药物后，药物经吸收、分布、代谢、排泄等过程，在体液中有浓度低、代谢复杂且代谢产物多等特点。通过应用液质联用技术可建立简便灵敏的体内分析方法，为该药在人体内的药代动力学研究提供一种可靠的检测手段。

谭志荣等［19］利用高效液相色谱－质谱检测方法，研究普伐他汀的人体药动学。血浆样品经固相萃取，以Thermo Hypurity C18柱为色谱柱，流动相为乙腈－0.2%甲酸水溶液(85∶15)，流速为 0.2 m l/min;采用ESI正离子方式进行检测。结果普伐他汀在2.52～660μg/L范围内线性关系良好;绝对回收率均在70%以上，相对回收率为98% ～102%，日内、日间 RSD均＜15%，可用于普伐他汀血药浓度检测和药动学研究。赵恒利［20］等建立LC－MS/MS法测定人血浆中氯马斯汀的浓度，该方法操作简便，分析周期短，定量限可达0.01 ng/ml，可用于氯马斯汀口服给药的药代动力学和生物等效性研究。

4.2 在药物代谢研究中的应用国内外多有采用LC－MS法进行药物代谢研究，不仅可以避免复杂的分离纯化代谢物样品，而且能分离鉴定难于辨识的痕量代谢产物，可以大大提高分析的专一性和灵敏度。

近年来在药物研究中用LC－MS/MS进行高通量生物分析的发展，应用快速液相萃取，高效毛细管的LC－MS/MS，检测多种药物血中、尿中的药物原型及其代谢产物［21］。徐友宣等［22］研究沙美特罗在小鼠体内的代谢过程，尿样经固相提取后用LC－MS－MS分析，根据代谢知识和阳性尿的响应数据，得出了沙美特罗的原型和四种代谢产物——羟基沙美特罗、羟基－甲氧基－沙美特罗、羰基－沙美特罗、羰基－羟基沙美特罗，从而推测沙美特罗可能的主要代谢途径为羰基化、甲基化以及两者的结合。赵宇峰等［23］采用人肠内细菌和乌头碱体外温孵的方法，探讨乌头碱的代谢产物16－O－去甲基去氧乌头碱在人肠内的生物转化。利用ESIMS/MS方法直接分析16－O－去甲基去氧乌头碱的代谢产物，乌头类生物碱在ESI正离子模式下形成质子化分子，结果成功检测并鉴定了16－O－去甲基去氧乌头碱被人肠内细菌转化，通过脱乙酰基、脱苯甲酰基、脱甲基、脱羟基以及酯化反应产生新型的单酯型、双酯型和脂类生物碱等10余种代谢产物。

总之，液质联用技术应用于药物及其代谢产物研究是该技术在医药领域应用最广泛、研究论文报道最多的领域。液相色谱与串联质谱联用显示了独特的优势，代表了药物代谢研究的发展趋势。

近年来，液相色谱－质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在药物分析领域应用越来越广泛，且在生物大分子分析(如在蛋白质分离和鉴定上应用)和临床诊断中都发挥重要作用［24］。随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱－质谱联用技术自身的优点，液相色谱－质谱联用技术必将在未来几年不断发展且在药物分析中发挥越来越重要的作用。

1 李忠红，王玉，倪坤仪.LC－MS在药物分析中的应用.药物分析杂志，2004，24(3):341

2 BiH，Hoffman K L，Pace G ，etal.Mixed－mechanism ionization to enhance sensitivity inatomospheric pressure ionization LC/MS.J Pharein Biomed Anal，2000，22(5):861

3 侯鹏飞，宿树兰，段金傲，等.液质联用技术分析延胡索中的生物碱类成分.中国医药导报，2008，5(11):48

4 薛长晖.液质联用分离测定山西苦荞黄酮.食品研究与开发，2009，30(1):103

5 马凤余，吴强，卫强.LC－MS分离鉴定头孢地嗪热降解的异构体杂质.药物分析杂志，2011，31(9):1833

6 Min Hu，Chang Qinhu.Identification of the components of 16－membered macrolide antibiotics by LC/MS.Analytica Chimica Acta，2005，535:89

7 来国防，程宾，鲁静.液相色谱－质谱联用测定抗风湿类中药中非法添加化学药物成分.时珍国医国药，2010，21(4):847

8 来国防，程宾，王梅.补肾壮阳类中药制剂中非法添加化学药物成分的检测.中国药学，2010，19(22):32

9 李晓燕，刘斐，郑静，等.液质联用检查降糖中药制剂中掺入的7种化学药品.中国药事，2008，22(11):980

10 崔福春，郭春，李丹.LC－MS/MS法快速测定安神类中成药、保健食品中非法添加的21种化学成分.中国当代医药，2009，16(25):8

11 闫韶华.液质联用仪在鉴别保健食品中茶碱成分的应用.数理医药学杂志，2010，23(4):480

12 关日晴，刘敏敏，李晨辉.液质联用法检测中成药和保健品食品中的6种肾上腺皮质激素.广东药学院学报，2011，27(2):151

13 王秀颖，许永国，周大庆，等.液相色谱/串联质谱法检测猪肉中三种化学物质的残留试验.山东畜牧兽医，2011，32:9

14 严志宏，万彦婷，卢珂，等.液质联用法测定金樱子中熊果酸和齐墩果酸的含量.江西中医学院学报，2010，22(6):43