liguzinediol对压力超负荷大鼠心室重构的影响

2012-02-10章嫡妮李卓琼卞慧敏

中国药理学通报 2012年12期

章嫡妮，郭瑶，李卓琼，李伟，2，卞慧敏，2

(1.南京中医药大学药学院，2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210046)

左心室压力负荷过重见于高血压，而高血压患者心室重构为心力衰竭的主要危险因素［1］，高血压的男性较血压正常的男性患心力衰竭的风险增加了2倍，女性为 4倍，严重危害人类健康［2］。随着ACEI抑制剂卡托普利的面市，人们把研发治疗CHF药物的重点逐渐集中到了寻找能够延缓、逆转心室重构的药物上来［3］。liguzinediol化学名为2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪，是对TMP进行结构修饰后得到的化合物，前期研究发现，liguzinediol能提高正常大鼠和心衰大鼠的LVSP、±dp/dtmax等，具有较强的正性肌力作用［4］，能够通过抗氧化应激、抑制炎症因子、抗心肌细胞凋亡等一系列途径来改善心室重构。较目前的抗心衰药物而言，liguzinediol具有水溶性强、生物利用度高、毒副作用小等优点，且药效可以维持2 h以上。本文旨在通过缩窄大鼠腹主动脉而造成压力超负荷的模型，观察给予liguzinediol对模型大鼠心功能、组织形态、胶原沉积和RAAS系统等方面进行研究，以此来探讨liguzinediol对压力超负荷型心室重构的影响。

1 材料

1.1 药品及试剂 liguzinediol(南京中医药大学药学院李伟教授提供，批号:20110506，纯度: 98.57%);卡托普利(中美施贵宝制药有限公司，批号:1102031);氯化钠(南京化学试剂有限公司，批号:09052420449);羟脯氨酸(HYP)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号:20111002);Ⅰ型胶原ELISA试剂盒(美国 Abcam 公司生产，批号: 20110608-004);Ⅲ型胶原ELISA试剂盒(美国Abcam公司生产，批号:20110608-007);血浆肾素活性放免药盒(北京华英生物技术研究所，批号: 20111204);血浆血管紧张素放免药盒(北京华英生物技术研究所，批号:20111207);血浆醛固酮放免试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号:20111206)。

1.2 仪器 RM6240系列多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂，批号:L30080185);莱卡倒置显微镜(德国莱卡公司生产);LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂生产);SPECTRA MAX 190酶标仪(AD公司生产);LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂生产);放免仪器(r-911全自动放免计数仪)。

1.3 实验动物 ♂SD大鼠，180～220 g，上海斯莱克实验动物中心，合格证号:SCXK(沪)2007-0005。

2 方法

2.1 大鼠压力超负荷心室重构模型制备［5］大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.36 g·kg－1麻醉，开腹，顺左肾向上找到左肾上腹主动脉搏动处，用玻璃分针分离肾上腹主动脉，于双肾动脉下方穿一根4-0号手术线，其上平行放置6号半针头，与腹主动脉一同结扎，其后抽出针头，于腹腔滴注青霉素抗感染，逐层关闭腹腔，术后连续3 d肌肉注射20万单位青霉素。假手术组手术方法同前，分离出肾上腹主动脉但不结扎。造模1周后，随机将大鼠分为6个组:模型组(model)、假手术组(sham)、liguzinediol低、中、高剂量组(5、10、20 mg·kg－1)以及卡托普利(10 mg·kg－1)组，连续灌胃给药8周。

2.2 心功能测定大鼠20%乌拉坦1.2 g·kg－1腹腔注射麻醉，仰位固定于恒温手术台上，四肢皮下插入心电图针形电极，记录心电图(ECG)。待心电、温度(37℃)稳定后，胸锁乳突肌内侧分离右颈总动脉，头端结扎进行动脉插管，经压力换能器与多导生理记录仪相连用于记录动脉血压变化:SBP、DBP、MAP，稳定后记录15 min，随后插管往心室方向插入，直至出现心室压力波形，稳定后测量左心室功能指标:LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax。

2.3 心肌组织形态学指标检测心功能指标测定完成后，迅速开胸取出心脏，于4℃生理盐水中洗净残余血液，滤纸吸干表面水分，称取全心质量;再沿房室间隔剔除心房及右心室，称取左心室(包括室间隔)的质量。计算心脏质量指数和左心室质量指数来衡量心肌肥厚程度，分别以HMI和LVMI来表示［6］。沿平行于冠状沟的平面将左心室切为两部分，一部分固定于10%甲醛溶液中，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察心肌组织的病理学变化。

2.4 心肌组织胶原沉积测定靠心底的另一部分左心室冻存于－80℃冰箱中，用于HYP及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的检测。

2.4.1 心肌组织HYP含量测定精确称取组织湿重30 mg左右放入试管中，准确加水解液0.5 ml，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20 min。调pH值至6.0～6.8左右，按试剂盒操作说明书加入各种试剂，最后混匀并离心，取上清在550 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。最后按以下公式进行计算:

2.4.2 心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定大鼠心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量。取左室心肌组织，称取其质量。加入PBS(pH 7.0～7.4)，缓冲液中加入1 μg·L－1蛋白酶抑制剂，匀浆，2 500 r·min－1离心20 min，离心后吸取上清。严格按照试剂盒说明书操作。

2.5 血浆学指标检测大鼠血流动力学检测完毕后，经左颈总动脉取血。将血液收集到预先加入抗凝剂的试管中，用于检测PRA、AngⅡ和ALD水平，抗凝剂组成:EDTA 2Na(30 μl)，8-羟基喹啉(30 μl)，二巯基丙醇(15 μl)，与血液混匀后离心(3 000 r·min－1，10 min)，离心(3 000 r·min－1，10 min)，吸取上清液，于－80℃冰箱中保存待测。参考试剂盒说明操作，采用放免法检测AngⅡ和ALD。

3 结果

3.1 liguzinediol对压力超负荷大鼠心功能的影响腹主动脉缩窄大鼠SBP、DBP、MAP等均较假手术组大鼠明显升高(P＜0.01)，且SBP及DBP均超过血压正常值，表现出明显的高血压症状，说明模型复制成功。卡托普利以及liguzinediol各个剂量组均有一定的改善动脉血压的效应，使SBP、DBP、MAP降低，其中liguzinediol 5、10、20 mg·kg－1剂量组与模型组比较差异均有显著性(P＜0.05)。见Tab 1。

Tab 1 Effect of liguzinediol on aterial blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1SBP/mmHg DBP/mmHg MAP/mmHg Sham － 108.00±7.84 64.68±9.63 79.12±8.89 Model － 191.30±14.66## 135.98±16.65## 154.42±14.09## Captopril 10 119.13±15.61＊＊ 70.15±16.42＊＊ 86.48±14.91＊＊5 154.08±25.87＊＊ 108.08±24.60* 123.42±24.69＊＊liguzinediol 10 136.50±22.70＊＊ 83.58±15.70＊＊ 101.22±16.92＊＊20 129.71±25.43＊＊ 83.41±13.95＊＊ 98.85±14.91＊＊

腹主动脉缩窄后，模型大鼠LVSP、±dp/dtmax较假手术组明显升高(P＜0.01)，说明造模9周后，大鼠心脏后负荷增加，血流动力学发生异常，左心室做功代偿性增加;LVEDP却没有发生明显改变，说明手术9周后，大鼠左心室舒张功能并未受到影响，心功能仍然处于代偿期，心脏为了维持对全身各组织器官的血供而增强收缩力。给药后，liguzinediol各剂量组以及卡托普利均可以明显降低LVSP(P＜0.05)，且liguzinediol的作用呈剂量依赖性。Liguzinediol 10、20 mg·kg－1组及阳性对照药卡托普利均能降低±dp/dtmax，与模型组大鼠差异有显著性(P＜0.05)，且与假手术组相比差异无显著性，表明liguzinediol可以调节±dp/dtmax至正常范围。见Tab 2。

Tab 2 Effect of liguzinediol on left ventricular blood pressure in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/mg·kg－1·d－1 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg +dp·dtmax－1/ mmHg·s－1－dp·dtmax－1/ mmHg·s －1 Sham － 112.35±6.9 1.80±3.89 7339±1347 －5494±736 Model － 171.94±16.56## 2.41±1.97 11994±2752## －8235±1035## Captopril 10 132.89±23.27＊＊ 2.22±2.75 8537±2662＊＊－6066±1686＊＊5 147.94±24.96* 3.00±1.73 9584±3273 －6460±1477* Liguzinediol 10 144.37±19.37* 2.23±2.43 8755±2303* －6025±757＊＊20 132.94±17.07＊＊ 3.50±3.45 7660±1920＊＊－5734±1461＊＊

3.2 liguzinediol对压力超负荷大鼠心肌组织形态学的影响腹主动脉缩窄9周后，模型大鼠心脏为了代偿后负荷的增加而发生肥厚，HMI和LVMI相应增大，二者与假手术组大鼠比较差异有显著性(P＜0.01)。给予liguzinediol可不同程度地改善心室肥厚现象，且呈剂量依赖性。见Tab 3。

HE染色光镜下观察，假手术组心肌细胞横纹清晰，未见增生肥大、萎缩、断裂，无细胞变性、坏死等病变，间质无水肿及炎性细胞浸润;模型组心肌纤维排列紊乱、细胞横径变大，并可见局灶性心肌纤维变性坏死，纤维结缔组织增生;liguzinediol各剂量组和卡托普利组能够不同程度地改善这一现象。见Fig 1。

Tab 3 Effect of liguzinediol on HMI and LVMI of LVH rats induced by abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1HMI/mg·g－1 LVMI/mg·g －1 Sham － 2.60±0.23 1.60±0.15 Model － 4.44±0.45## 2.55±0.23## Captopril 10 3.51±0.83* 2.05±0.46* 5 3.90±0.70 2.25±0.39 Liguzinediol 10 3.81±0.45* 2.20±0.34* 20 3.84±0.323＊＊ 2.22±0.27*

3.3 liguzinediol对压力超负荷大鼠心肌组织胶原沉积的影响模型大鼠心肌组织HYP含量明显增加(P＜0.01)，各给药组均有降低HYP的作用，liguzinediol能够剂量依赖性地降低HYP含量，与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)，见Tab 4。根据标准曲线计算出各组胶原含量，并作出比值，见Fig 2和Fig 3。结果显示:与模型组相比，Ⅰ型胶原含量明显增加(P＜0.05)，就两者比值而言，模型组大鼠心肌组织中Ⅰ/Ⅲ型胶原比值也明显增加(P＜ 0.01)，表明腹主动脉缩窄诱导大鼠心肌间质胶原沉积。给予liguzinediol能明显降低二者比值(P＜0.05)，改善胶原沉积现象。3组Ⅲ型胶原之间虽有变化，但差异均无显著性。见Tab 5。

Fig 1 Heart tissues.HE stain(200×)

Tab 4 Effect of liguzinediol on the content of HYP in the rats’heart(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/mg·kg－1·d－1 HYP/mg·g －1 Sham － 0.16±0.03 Model － 0.46±0.08## Captopril 10 0.24±0.06＊＊5 0.24±0.07＊＊liguzinediol 10 0.23±0.03＊＊20 0.20±0.02＊＊

3.4 liguzinediol对压力超负荷大鼠血浆RAAS的影响腹主动脉缩窄大鼠血浆中PRA、AngⅡ、ALD水平较假手术组明显上升(P＜0.01)，卡托普利和liguzinediol均能够明显降低AngⅡ、ALD血浆水平，尤其对ALD的降低最为明显。但是各药均不能降低PRA。结果表明，liguzinediol主要是通过降低血浆中AngⅡ、ALD的含量来影响RAAS的。见Tab 6。

Tab 5 Effect of liguzinediol on the of collagen type I:Ⅲratio in rats with abdominal aortic constriction(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1 Type I collagen/ μg·L－1 TypeⅢcollagen/ μg·L－1 I/ⅢSham － 30.23±2.82 6.92±0.36 4.36±0.23 Model － 34.56±1.81# 6.67±0.27 5.31±0.32## liguzinediol 20 34.08±1.59 6.97±0.50 4.90±0.30*

Fig 2 Standard curve of collagen type I of isolated rat hearts by Elisa

Fig 3 Standard curve of collagen typeⅢof isolated rat hearts by Elisa

4 讨论

腹主动脉缩窄是由于肾血流量相对减少，激活RAAS，引起血管收缩，血压升高，心脏后负荷进一步增加，而长期负荷过重是引起心室重构的主要原因。心室重构的临床表现为心肌重量、心室容量的增加和心室形态的改变。本实验造模9周后 HMI及LVMI增加，说明模型大鼠心脏已经发生了器质性改变，形成心室重构;蔡辉等［6］报道相同模型大鼠心肌纤维排列紊乱、细胞横径变大，并可见局灶性心肌纤维变性坏死，纤维结缔组织增生，本研究模型组结果与这一现象相符，说明模型复制成功，而给予卡托普利和liguzinediol各剂量组治疗后，HMI、LVMI以及心肌组织病理学均得到不同程度的改善。

Tab 6 Effect of liguzinediol on AngⅡ，PRA and ALD of rats with abdominal aortic constriction(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;##P＜0.01 model vs sham

Group Dose/ mg·kg－1·d－1 PRA/ μg·L－1·h－1 AngⅡ/ ng·L－1 ALD/ ng·L －1 Sham － 2.91±0.13 120.40±18.03 93.39±11.87 Model － 3.72±0.24## 142.28±5.85## 124.59±8.28## Captopril 10 3.55±0.22 125.51±14.64＊＊ 90.16±8.70＊＊5 3.75±0.19 133.33±8.06* 108.44±5.63＊＊liguzinediol 10 3.61±0.31 129.62±10.48* 99.93±13.75＊＊20 3.48±0.31 124.69±12.10＊＊ 97.75±9.42＊＊

本实验腹主动脉缩窄大鼠SBP、DBP、MAP均明显升高，表现出高血压症状;而LVSP、±dp/dtmax也明显升高，说明心脏后负荷增加，左心室做功代偿性增加;LVEDP却没有明显改变，说明术后9周左心室舒张功能并未受到影响，心功能仍处于代偿期，心脏为了维持对全身各器官组织血供而增强收缩力。给药后，liguzinediol各剂量组以及卡托普利均可不同程度降低SBP、DBP、MAP、LVSP、±dp/dtmax，说明liguzinediol能通过降低过高的后负荷，来改善大鼠血流动力学各项指标，改善心功能。

纤维性胶原是心脏中最多的胶原类型，其中最经典的是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原［7］，而本实验造成的模型尚处于心肌肥厚导致心肌重构的早期(代偿性)，此阶段主要与Ⅰ型胶原沉积，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增高有关，而Ⅲ型胶原变化不大［8］;测定心肌组织HYP含量可反映心肌胶原蛋白的含量，从而判断心肌间质细胞增殖和纤维组织增生的程度。本研究显示，模型大鼠Ⅰ/Ⅲ型胶原比例及心肌组织HYP含量与假手术组相比明显增加，说明压力超负荷导致心肌组织胶原沉积增加、心肌纤维化发生、心肌僵硬度增加，而liguzinediol可以减小Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比值及HYP含量，提示liguzinediol可以通过减少胶原沉积来改善心肌纤维化。

心室重构的发生发展中，伴随着RAAS系统的激活，进而促进一系列内源性神经内分泌因子的生成，其中主要的效应分子为肾素、AngⅡ和ALD，对心血管疾病的发展起着重要作用［9－10］。本实验中模型大鼠血浆PRA活性、AngⅡ、ALD含量较假手术组均明显升高，三者相互关联、相互促进，共同参与心室重构的病理进程。Doeving等［11］报道卡托普利可以降低血浆AngⅡ及ALD水平，但并不能降低PRA水平，这与本实验结果一致。liguzinediol也只能降低血浆AngⅡ及ALD水平，而不能降低PRA水平，提示liguzinediol抑制RAAS活性的作用可能主要是通过降低AngⅡ、ALD来实现的。

由此可见，liguzinediol能改善压力超负荷大鼠的心室重构，且具有一定的剂量依赖性，其作用机制可能与抑制RAAS活性有关，其他机制有待进一步深入研究。

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