黄 成，马陶陶，李 浩，李政通，章胜朋，邓子煜，李 俊

(1.安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级重点实验室，国家中医药管理局中医药三级实验室“中药药理实验室”，安徽合肥 230032;2.安徽医科大学第二附属医院，安徽合肥 230601)

肝纤维化是肝脏对于各种慢性损伤的修复反应，以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏内大量沉积为病理特征。瘦素(leptin)是肥胖基因编码的肽类激素，具有重要的生理作用。研究显示，瘦素参与肝纤维化的形成，瘦素致纤维化的机制与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)密切相关［1－2］。豹皮樟总黄酮(total flavonoids of Litsea coreana Levl，TFLC)是从药食同源植物豹皮樟提取的有效部位。前期研究表明，TFLC具有良好的抗炎和免疫调节作用，对酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎均具有较好的防治作用［3－4］，对肝纤维化大鼠具有治疗作用［5］。本实验将在前期研究的基础上，进一步研究TFLC对CCl4诱导肝纤维化大鼠的预防作用，并深入探讨TFLC对瘦素、瘦素受体(leptin receptor，Ob-Rb)及TGF-β1/Smads通路蛋白表达的影响，为TFLC防治肝纤维化提供实验和理论依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 豹皮樟总黄酮，由本院天然药物化学室研制，总黄酮含量＞70%;秋水仙碱购于版纳药业有限公司，临用前均以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度的混悬液。CCl4，分析纯，购于汕头西陇化工厂，临用前用花生油1∶1稀释。谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 羟 脯 氨 酸(hydroxyproline，Hyp)测定试剂盒购于南京建成生物科技公司。透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原氨端肽(procollagenⅢN-terminal peptide，PⅢNP)、Ⅳ型胶原(procollagenase IV，CⅣ)放免试剂盒购于北京北方生物技术研究所。Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、TGF-β1、leptin ELISA试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。TRIzol Reagent购于Invitrogen公司。Reverse Transcription System逆转录试剂盒与PCR试剂盒购于Fermentas公司。Ob-Rb、TGFβ1Ⅰ型受体(TGFβR1)、Smad3、β-actin引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。小鼠抗Ob-Rb、TGFβR1、Smad3抗体购于美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记二抗购于北京中杉公司;ECL发光试剂盒购于Pierce公司。

1.2 实验动物 ♂SD大鼠，体质量200～220 g，由安徽医科大学实验动物中心提供(动物合格证号:皖医实动准字第01号)。动物自由进食、饮水，1周后使用。

2 方法

2.1 动物分组与处理 大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组、模型组、给药组(低剂量组100 mg· kg－1、中剂量组200 mg·kg－1、高剂量组400 mg· kg－1)，每组10只。除正常组外，其余各组每周二、周五皮下注射50%CCl4花生油溶液(1 ml·kg－1)，连续12周;正常组皮下注射等量的花生油溶液。给药组于造模第1周起灌胃给予TFLC，每天1次，直至造模结束;正常组和模型组灌以等量的生理盐水。第12周末，大鼠禁食12 h，2%戊巴比妥钠(30 mg· kg－1)麻醉，腹主动脉采血，常规制备血清;留取肝脏组织标本，检测相关指标。

2.2 血清学指标检测 大鼠取血后室温静置1 h，3 000 r·min－1离心15 min，分离血清。检测血清中ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ及Ⅰ型胶原、瘦素、TGF-β1。

2.3 组织学指标检测 肝组织石蜡切片Masson染色观察形态学改变，制备肝匀浆，检测肝组织Hyp含量。

2.4 RT-PCR分析Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3的mRNA水平 按TRIzol试剂盒说明书，提取肝脏组织总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书，逆转录合成cDNA。引物序列见Tab 1。以β-actin为内参照。PCR反应产物置1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶成像系统进行密度扫描，以各扩增产物对β-actin光密度值的比值表示目的基因的相对量。

2.5 Western blot检测肝组织中 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3蛋白水平 取大鼠肝组织100 mg，加入1 ml RIPA组织裂解液(每ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上进行组织匀浆，12 000 r·min－1，4℃，离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。每孔加样量为20 μg蛋白(浓缩胶电压80 V，分离胶100 V)。电泳结束后由半干转仪器将蛋白转移到PVDF膜上，电压20 V，时间15 min。膜于室温下以含50 g ·L－1脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h，漂洗后加入一抗(Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3)，4℃过夜。再分别加入与一抗相匹配的二抗，室温放置1 h。ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内参，分析条带吸光值。

2.6 统计分析 采用SPSS 13.0进行单因素方差分析及t检验处理，等级资料采用非参数秩和检验，结果以±s表示。

3 结果

3.1 TFLC对 CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型胶原及肝组织Hyp的影响 模型组血清ALT、AST水平与正常组比较明显增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg· kg－1)明显降低模型大鼠血清ALT、AST水平(P＜0.05，P＜0.01)，表明TFLC具有肝脏保护作用(Fig 1a);模型组血清肝纤维化指标HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝组织中Hyp与正常组比较明显增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明显降低模型大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝组织Hyp水平(P＜0.05，P＜0.01)，见Fig 1b、c、d、e;以上实验结果表明，TFLC对肝损伤及肝纤维化大鼠具有预防作用。

3.2 TFLC对CCl4诱导的肝纤维化大鼠病理形态学影响 Masson染色结果显示，正常组肝组织结构完整，肝细胞排列整齐;模型组肝组织有大量胶原纤维沉积，纤维间隔粗大，形成假小叶;TFLC(200、400 mg·kg－1)明显减轻纤维沉积，纤维间隔变窄，表明TFLC可明显降低肝纤维化程度(Fig 2)。

Tab 1 Sequences of the primers used in the PCR measurements

3.3 TFLC对 CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清Leptin、TGF-β1的影响 模型组瘦素和TGF-β1含量明显增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明显降低模型大鼠血清瘦素和TGF-β1的含量(P＜ 0.05，P＜0.01)，见Fig 3a、b。

Fig 1 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum alanine transaminase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，hyaluronic acid(HA)，laminin，procollagenⅢN-terminal peptide(PⅢNP) and procollagenase IV(CIV)，hydroxyproline，Collagen Ι and liver Hyp contents in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(¯x± s)

Fig 2 Photomicrographs of liver sections stained with Masson's trichrome(×200)

3.4 TFLC对CCl4诱导的模型大鼠Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA与蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组肝组织中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mR-NA及蛋白表达均明显增高(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)可明显降低上述各项指标 (P＜0.05，P＜0.01)，见Fig 4。表明TFLC预防肝纤维化机制可能与降低Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3表达有关。

Fig 3 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum Leptin and TGF-β1 level in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(±s)

Fig 4 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on Ob-Rb，TGF-βR1，Smad3 mRNA and protein level in liver fibrosis rats.mRNA and protein are corrected by β-actin(±s)

4 讨论

肝纤维化以ECM的过度沉积为特征。胶原蛋白、蛋白多糖、非胶原性糖蛋白是构成ECM的3大类物质［6］。HA是构成ECM中蛋白多糖的主要成分，LN为一种重要的糖蛋白，PⅢNP与肝纤维化的程度呈定量的明显相关关系，CⅣ可反映肝细胞损伤、纤维化程度;Hyp为胶原蛋白特有的氨基酸，在肝组织其含量可反映胶原增生与纤维化程度，Ⅰ型胶原是构成胶原蛋白的重要成分［7－8］，以上指标联合检测对肝纤维化具有重要诊断价值。本研究中，CCl4诱导肝纤维化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型胶原及肝组织Hyp明显升高，TFLC(200、400 g ·L－1)可明显降低血清中升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型胶原及肝组织中Hyp水平;病理形态学检测发现，TFLC(200、400 mg·kg－1)明显减轻纤维沉积，纤维间隔变窄;以上实验结果表明，TFLC能够有效预防CCl4诱导的大鼠肝纤维化。

研究证实:活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化ECM的主要来源细胞。HSC的活化、增殖是肝纤维化的关键事件，这一复杂的病分子网络共同调控的结果，TGF-β1是其必需的调节因子［9］。在TGF-β1细胞内信号传导通路中，Smad蛋白为关键的信号传导分子。研究显示:动物肝纤维化往往伴随血清及组织TGF-β1增加，HSC数量进行性增多，Smad3表达明显增高。在纤维化形成过程中，瘦素可上调TGF-β1。瘦素具有细胞因子特性，与细胞表面的瘦素受体结合发挥生物学作用［10］。Honda等［11］在研究瘦素缺陷的小鼠(ob/ ob)和天然瘦素受体缺陷大鼠(fa/fa)发现，肝纤维化明显被抑制，肝脏α1(Ι)前胶原mRNA表达明显降低，而且肝内TGF-β1和HSC活化也被抑制;如果补充瘦素至生理水平，ob/ob小鼠可出现明显的肝纤维化，并且肝内TGF-β1水平、α1(Ι)前胶原mRNA水平也明显提高;Leclercq等［12］的研究也得出同样的结果。提示瘦素可上调TGF-β1水平增强肝纤维化的形成［13］。本实验发现，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，外周血瘦素和TGF-β1含量增高;肝组织中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA及蛋白表达增强;而TFLC对模型大鼠外周血瘦素、TGF-β1含量及组织中TGF-βR1、Smad3、瘦素受体的表达有明显的降低作用。以上结果表明，TFLC预防肝纤维化的作用机制可能与下调瘦素及其受体，抑制TGF-β1/Smad通路有关。

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