沈宏伟，靳国杰，胡翠敏，龚志伟，白凤武，赵宗保,3

1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023

2 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023

3 大连洁净能源国家实验室 (筹)，辽宁 大连 116023

能源短缺和环境污染给当今社会可持续发展带来双重压力。一些研究者认为可再生、环境友好的燃料在近期内最有可能取代化石燃料而缓解这个问题[1-2]。生物柴油与化石柴油性质相近，但燃烧排放的污染气体远低于化石柴油[3]。生物柴油所用原料主要来源于植物油脂、动物脂肪和废弃油脂，明显受时间、地点以及季节等条件影响，很难满足生物柴油规模化生产需求。微生物油脂主要指通过酵母、细菌和霉菌等微生物将碳水化合物或碳氢化合物转化成的甘油酯，其脂肪酸成分和植物油相似。由于微生物油脂生产可有计划地实施，已成为潜在的油脂获取新路线[4]。

针对微生物油脂，国内外学者做了大量研究工作。通过研究油脂合成发现有机氮源能够提高某些产油微生物胞内的油脂含量[5-6]，在限制硫源[7]或磷源[8]条件下也能够促进油脂积累。为了拓展油脂发酵底物来源，甘油[9-10]、淀粉[11]、淀粉废水[12]、菊芋[13]、糖蜜[14]和污水[15]等被用来转化合成油脂。在油脂发酵方式中，进行了批式发酵[16]、批式补料发酵[17-18]、连续发酵[19]和部分菌体循环的连续发酵[20]研究。

在一些产油微生物连续培养研究中发现：稀释率下降，胞内油脂含量和细胞干重增加[21]，稀释率减小有助于油脂生产，但稀释率过低对油脂生产不利[22]。胞内油脂含量随着碳氮比增大而增加，油脂脂肪酸成分不受碳氮比影响，但脂肪酸相对含量有所变化[14,23]。圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.138 9油脂含量高，生长速度快。研究发现当培养基中的碳氮比为 420时，胞内油脂含量可达 76%，但在培养120 h后，生物量仅为10.7 g/L[24]。在两阶段培养中，将第一阶段增殖的圆红冬孢酵母回收后，在第二阶段重悬于葡萄糖培养液中可实现油脂快速积累[25]。目前，关于圆红冬孢酵母连续培养未见报道。本文采用恒化培养方式，考察在稳态条件下稀释率和碳氮比对圆红冬孢酵母油脂积累的影响。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

圆红冬孢酵母菌 Rhodosporidium toruloides AS 2.138 9购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)

1.2 培养基

YEPD液体培养基 (g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，培养基初始pH值用1 mol/L NaOH调至6.0。固体培养基在YEPD液体培养基基础上加入15 g/L琼脂粉。

批式发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 100，酵母粉5，硫酸铵5，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.5。

恒化培养基1 (g/L)：葡萄糖70，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉0.75，硫酸铵0.1，pH 5.6。

恒化培养基2 (g/L)：葡萄糖40，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉0.75，硫酸铵0.1，pH 5.6。

1.3 培养方法

种子液培养：将新鲜斜面圆红冬孢酵母接种于50 mL YEPD液体培养基中，于30 ℃、200 r/min摇床上培养，培养24 h后，取20 mL转接到180 mL YEPD液体培养基中，培养24 h。

批式培养：将培养24 h的种子接种到3 L发酵罐 (上海保兴 3-BG) 中，接种量为 10%，接种后体积为2 L。培养温度30 ℃，pH通过自动流加1.5 mol/L NaOH控制在5.6，通气量50 L/h，发酵时通过溶解氧与搅拌联动控制溶解氧在45%左右。

恒化培养：批式发酵至35 h时，蠕动泵补加新鲜发酵培养基，开始恒化培养，恒化培养工作体积为1.55 L。间隔一定时间取样，测量残糖含量和OD600，当残糖和OD600基本不变时培养进入稳态。当改变培养条件 (稀释率或碳氮比) 后，连续流加5个工作体积培养基，然后开始取样，每间隔3 h取1次，共取3次，分析生物量和残糖，基本恒定时确定为稳态。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量测定

发酵液离心去掉上清液，收集沉淀，加入蒸馏水离心洗涤2次，于105 ℃烘至恒重，以g干菌体/L发酵液表示菌体生物量。

1.4.2 油脂提取

采用酸热法，油脂含量为油脂量占生物量的质量百分数[13]。

1.4.3 残糖测定

采用山东省科学院生产的 SBA-50B生物传感分析仪进行葡萄糖测定。

1.4.4 氮含量的测定

凯氏定氮法，用KDN-2C型定氮仪 (上海嘉定纤检) 测定。

1.4.5 油脂脂肪酸组成分析

采用GC-7890型气相色谱仪进行分析。色谱条件为：FFAP石英毛细管柱 (30 m×0.32 mm× 0.4 μm)；进样器温度250 ℃；进样量0.2 μL；载气N241 mL/min，检测器 (FID) 温度280 ℃；H233 mL/min，空气100 mL/min；柱温190 ℃；分流进样。脂肪酸通过对照标准样品定性，采用面积归一法确定相对含量。

2 结果与分析

2.1 连续培养中稳态的确定

圆红冬孢酵母在批式培养进行到35 h后，开始以D=0.02 h−1的稀释率补加新鲜的恒化培养基1，并以相同速率排放出发酵液。随着恒速补料进行，发酵液中残糖逐步升高，生物量逐渐下降。当连续培养进行到 265 h后，发酵液中残糖和OD600不再变化，培养进入了相对稳态。此时，发酵液中残糖稳定在 55 g/L左右，OD600在 12左右 (图 1)。从恒速补料到进入稳态培养了230 h，运行了4.6个工作体积，这与其他产油酵母恒化培养中到达稳态的结论基本一致[26]。因此，在圆红冬孢酵母连续培养中，条件改变后流加5个工作体积培养可进入稳态。

2.2 稀释率对油脂积累的影响

通过流加恒化培养基 2，稀释率从 0.02 h−1增加到0.24 h−1，圆红冬孢酵母胞内油脂含量和生物量呈现出相反趋势。油脂含量从57.1%下降到10.4%，生物量由4.0 g/L下降到不足0.5 g/L，而残糖含量则逐渐升高 (图2)。可见稀释率对圆红冬孢酵母油脂含量和生物量影响比较明显。Gill等考察在以葡萄糖为底物的情况下，稀释率从0.06 h−1到0.21 h−1对Candida 107油脂积累的影响，在稀释率为0.06 h−1时获得最大油脂含量，为40%[27]。Alvarez等以甘蔗糖蜜为底物，考察不同稀释率对 Rhodotorula glutinis油脂积累的影响，发现随着稀释率减小，胞内油脂含量逐渐增加，在稀释率为0.04 h−1时获得了最大油脂含量[14]。可见在不同产油微生物和不同底物条件下，胞内油脂含量均随着稀释率减小而增大。工业生产过程中产物得率和生产强度是两个重要指标。从表1中可以看到，随着稀释率增大，油脂得率和菌体得率逐渐下降，在0.02 h−1时油脂得率和菌体得率均最大，分别为 0.18 g 油/g糖和0.31 g菌体/g糖。当稀释率由0.24 h−1减小到0.02 h−1时，油脂得率提高9倍，菌体得率提高1.8倍。油脂最大生产强度出现在D=0.14 h−1时，表明在此条件下油脂合成和菌体生长均处在较旺盛状态。

图1 圆红冬孢酵母的连续培养Fig. 1 Continuous culture of R. toruloides.

图2 稀释率对圆红冬孢酵母油脂发酵的影响Fig. 2 Effect of dilution rate on lipid accumulation by R. toruloides.

表1 不同稀释率下油脂发酵结果Table 1 Results of lipid production by R. toruloides in under different dilution rate

从以上结果可以看出：稀释率对圆红冬孢酵母连续发酵生产微生物油脂影响较大。在低稀释率下有利于获得较高油脂得率，但不利于提高油脂生产强度。因为在较低稀释率下，氮源严重不足，限制了微生物增殖。由于油脂是胞内产物，其产量同时受到胞内油脂含量和微生物数量影响。

2.3 碳氮比对油脂积累的影响

在产油微生物培养过程中，当氮源匮乏时腺苷一磷酸 (AMP) 脱氨酶活性增强，将AMP转化为肌苷一磷酸 (IMP) 和氨。通常产油酵母线粒体中异柠檬酸脱氢酶 (ICDH) 为AMP依赖型脱氢酶，细胞内AMP浓度降低将减弱该酶的活性，导致线粒体内柠檬酸含量增加。柠檬酸透过线粒体膜进入细胞溶胶，在腺苷三磷酸：柠檬酸裂解酶 (ACL) 作用下裂解生成乙酰辅酶A和草酰乙酸，在脂肪酸合酶 (FAS) 作用下完成脂酰辅酶A合成[28]。

在考察碳氮比对油脂含量影响研究中，Turcotte等研究发现碳氮比为77时，不论何种氮源菌体内油脂含量均在30%以上[29]。李永红等通过优化培养基，在碳氮比为420时，圆红冬孢酵母油脂含量达到76%[24]。Papanikolaou等报道当培养基碳氮比从83.5增加到133.5时，刺孢小克银汉霉 Cunninghamella echinulata油脂含量从36%增加到47%；深黄被孢霉Mortierella isabellina油脂含量由50%提高到56%[30]。本文通过恒化培养的方式，在D=0.1 h−1的条件下考察了碳氮比对圆红冬孢酵母油脂发酵的影响 (表2)。

表2 不同碳氮比培养基主要成分Table 2 Composition of medium in different C/N ratios

图3 碳氮比对圆红冬孢酵母油脂积累的影响Fig. 3 Effect of C/N ratios on lipid accumulation by R. toruloides.

从图3中可以看出：培养基中初始碳氮比增大，菌体内油脂含量逐渐增大。当碳氮比由 18增大到237时，菌体内油脂含量由28.8%增加到38.0%，仅提高9.2%。可见，在恒化培养中增大碳氮比虽然能够提高菌体内油脂含量，但是变化不明显。因为在连续培养过程中，油脂积累不仅和培养基初始碳氮比相关，同时也受稀释率影响。在碳氮比一定的情况下，稀释率较大，单位时间内流过生物反应器的培养基较多，导致反应器内营养成分丰富，氮源充足，因此不利于油脂积累。而随着稀释率减小，反应器内氮源匮乏，有利于油脂积累。而当稀释率一定的情况下，培养基中碳氮比越大，反应器内氮源较为匮乏，有利于油脂生成。反之，则不利于油脂合成。但当碳源充足情况下，油脂合成更依赖于稀释率[31]。生物量随着碳氮比增加呈现逐渐下降。这主要是因为当碳氮比大于 92时，发酵液中氨氮含量仅为0.01 g/L，氮源成为生长限制因素，导致生物量下降。Hassan等通过连续发酵发现：随着被消耗碳氮比减小，生物量和油脂含量均呈下降趋势[23]，李永红等在油脂批式发酵研究中也表明：胞油脂含量随着初始碳氮比减小而下降[24]。可见，油脂发酵初始碳氮比和被消耗碳氮比均与产油微生物胞内油脂含量呈相同趋势。

通过表3可以看出：随着培养基中碳氮比增大，油脂得率变化不大。菌体得率在碳氮比从18增加到92时变化不大，在237时明显降低。可见在高碳氮比下细胞生长明显受到抑制。李永红等[24]的研究论文也有过相同报道，但其在批式发酵中碳氮比高达694时才产生抑制作用，这是因为两种培养模式不同。批式培养过程中的环境随培养时间变化，恒化培养在稳态条件下其环境相对稳定，更有利于考察不同条件对微生物生长和产物积累影响。油脂生成速率和菌体生成速率随着碳氮比增大均先升高后降低。在碳氮比为32时，获得最大油脂生成速率和菌体生成速率，分别为0.13 g/(L·h) 和0.40 g/(L·h)。

2.4 碳氮比对油脂脂肪酸成分的影响

将油脂转酯化后，采用气相色谱法对5个不同碳氮比下获得的油脂脂肪酸成分进行分析。从表4中可以看到：不同碳氮比对油脂脂肪酸组成影响不大，脂肪酸主要包括肉豆蔻酸 (14∶0)、棕榈酸 (16∶0)、棕榈油酸 (16∶1)、硬脂酸(18∶0)、油酸 (18∶1)、亚油酸 (18∶2) 和亚麻酸 (18∶3)，这和已报道的结果一致[18]。油脂脂肪酸成分主要是棕榈酸、硬脂酸和油酸，三者的含量占油脂总脂肪酸含量85%以上。这些油脂的脂肪酸组成和含量表明其可作为生物柴油的原料[32]。

表3 不同碳氮比下油脂发酵结果Table 3 Results of lipid production by R. toruloides under different C/N ratios

表4 不同碳氮比下油脂脂肪酸成分Table 4 Fatty acids compositions of lipid samples produced under different initial C/N ratios

3 结论

圆红冬孢酵母经过5个工作体积恒化培养后进入稳态。在稳态条件下，菌体内油脂含量、油脂得率和菌体得率随稀释率增大而减小。油脂生成速率和菌体生成速率在稀释率为0.14 h−1时最大。在稳态条件下，随着碳氮比增大，菌体油脂含量逐渐增加。当碳氮比从18增加到237时，油脂含量提高 9.2%。碳氮比对菌体得率影响不明显，但油脂得率随碳氮比增大有所增高。在碳氮比为 32时，获得最大油脂生成速率和菌体生成速率。在低稀释率和高碳氮比时，有利于胞内油脂积累，但由于在此条件下氮源严重缺乏，菌体生长受到限制，不利于提高油脂生产强度。碳氮比对油脂脂肪酸组成没有明显影响，但脂肪酸相对含量上有所不同，棕榈酸、硬脂酸和油酸总含量超过85%。

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