陈耀国

(上海联合赛尔生物工程有限公司，上海201206)

周质空间(periplasmic space)是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构，能够提供一个适合外源蛋正确折叠的环境.利用大肠杆菌系统，在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽，可将目的蛋白运送到周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)［1］.本研究所构建的工程菌可分泌人生长激素到周质空间中，并采用渗透压冲击法提取目的蛋白.

1 材料和方法

1.1 菌株 Escherichia coli BL21(Novagen公司)，质粒pIN－III－OmpA－hGH由公司研发工艺部提供.

1.2 培养基

1.2.1 摇瓶培养基 选用LB培养基，用前加入氨苄西林钠50 mg⋅L－1.

1.2.2 发酵培养基 Glucose 5 g⋅L－1，Tryptone 10 g⋅L－1，Yeast extract 5 g⋅L－1，KH2PO43 g⋅L－1，Na2HPO46 g⋅L－1，(NH4)2SO41.2 g⋅L－1，MgSO40.5 g⋅L－1，CaCl20.15 g⋅L－1，泡敌0.2 mL⋅L－1(葡萄糖单独灭菌，发酵前加入).

1.2.3 补料培养基 Glucose 350 g⋅L－1，Tryptone 300 g⋅L－1.

1.3 发酵罐 5 L发酵罐，为上海保兴生物设备工程有限公司产品.

1.4 种子液的制备 取－70℃甘油菌1‰接种到50 mL (250 mL锥形瓶)的LB培养基中，37℃，200 r⋅min－1，培养12～15 h进行菌种活化.将活化好的菌液以2%的接种量加入到200 mL(500 mL锥形瓶)LB培养基中，37℃，200 r⋅min－1，培养4～5 h即为种子液.

1.5 发酵培养 培养基体积为3 L，pH控制在7.20±0.20，由发酵控制系统自动补入4 mol⋅L－1NaOH调节培养基pH.培养温度控制在(37±0.5)℃，发酵过程控制溶氧在30%以上，当溶氧低于30%时通过提高通气量和搅拌速度提高溶氧.当发酵进行到3.5～4 h后，溶氧开始上升时，以25～30 mL⋅h－1的流速滴加补料液，补料体积为300 mL.

1.6 周质蛋白的提取 取200 mL的发酵液，加入不同浓度的蔗糖和EDTA，室温150 r⋅min－1，温育20 min，4℃ 14 000 ×g离心20 min，弃高渗液，向菌泥中加入60 mL的4℃ RO水，轻轻搅匀，冰浴20 min，4℃14 000×g离心20 min，得60 mL上清液即为周质蛋白，试验重复两次.

蛋白含量测定:采用Bradford法［2］.以对照品溶……