禹文海，黄 芬，杨凤梅，鲁帅尧，赵 远，王俊斌，陈丽雄，李艳艳，和占龙

(1.中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650224)

恒河猴 (Macaca mulatta)隶属于灵长目(Primates)猴科(Cercopithecidae)猕猴属(Macaca)，为国家Ⅱ级保护动物和重要的实验灵长类动物，是非人灵长类中分布最广且数量最多的一个类群，广泛分布于中国、缅甸、尼泊尔、印度北部、孟加拉国、巴基斯坦等地。在我国主要分布于南方诸省(区)，以广东、广西、云南、贵州等地分布较多，福建、安徽、江西、湖南、湖北、四川次之，海南、陕西、山西、河南、河北、青海、西藏等局部地点也有分布。由于恒河猴在形态、生殖生理特性和生化代谢等方面与人类非常相似，而且遗传物质与人类具有较高的同源性，是进行医学和生物学等领域研究较为理想的实验动物［1］。

线粒体 DNA(mitochondrial DNA，m tDNA)呈母系方式遗传，无重组，进化速率快。其中，mtDNA控制区的进化速度是线粒体DNA其它区域的3～5倍，而且不编码任何基因，在生物遗传进化及种群遗传变异程度的研究中应用广泛［2-6］。本研究以分布于云南不同地区的96份恒河猴样品作为研究对象，采用DNA测序技术测定m tDNA控制区全序列，初步确定云南地区恒河猴群体遗传多态性，为今后开展恒河猴遗传资源保护和合理开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

96份恒河猴全血样品来自中国医学科学院医学生物学研究所全国医学灵长类研究中心实验动物部［实验动物生产许可证：(滇)SCXK2010-0006］。其中，23份为本中心自繁恒河猴(昆明市)，其余73份恒河猴为从野外捕获的原种群，来源地清晰。在73份野外恒河猴中，景东县21份、镇沅县21份 、宁蒗县24份、保山市2份、牟定县2份、邓川镇1份、镇康县1份、维西县1份。样品来源地理位置见图1。

1.2 试剂和仪器

Axygen DNA提取试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)，2×PCR Master Mix、ddH2O、DNA marker DL2000和6×电泳上样缓冲液(北京天根生化科技有限公司)，台式离心机(Legend Micro 21R)，梯度PCR仪(Bio-Rad C1000)，DYY-2C型电泳仪电源和DYCP-31DN型电泳仪(北京市六一仪器厂)，UVP凝胶成像系统(美国基因有限公司)。

参考相关文献设计引物［7，8］，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物F：CCTTACCTGAA TTGGAAGCGAACC；下游引物R：GGCCAGGACC AAGCCTATTT。

图1 云南地区恒河猴样品来源地理位置Fig.1 The sampling sites of the Macaca mulatta in Yunnan province

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取：静脉抽取全血2m L，EDTA抗凝。采用 Axygen DNA提取试剂盒提取基因组DNA，详细操作步骤见说明书。-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增：反应体积为25μL，上游引物F和下游引物R各(20μmol/L)0.5μL，模板DNA 2μL，2×PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。反应条件为95℃预变性6m in；然后94℃变性1min，66℃退火 45s，72℃延伸 1m in，40个循环；最后72℃延伸10min。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳及 PCR产物直接测序：用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，参照DNA marker DL2000，对1450bp左右的PCR产物进行纯化测序，测序由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.3.4 数据处理与结果分析：每个个体测得的正反链序列用DNAStar软件进行分析拼接，Clustalx 1.8软件进行序列比对并辅以人工校对，Mgea 4.0软件分析序列的碱基组成、转换和颠换，用 DNA SP (Version 4.10.8)软件分析变异位点数(variation sites)、简约信息位点数 (parsimony informative sites)、单倍型数(haplotypes，h)、单倍型多样度(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多样度(nucleotide diversity，Pi)、平均核苷酸差异(average No.of nucleotide differences，K)等。以食蟹猴(GenBank登录号：FJ906803)为外群，用邻接法(neighbor-joining，NJ)和最小进化法(minimum-evolution，ME)构建分子系统发生树。

2 结果

2.1 PCR产物电泳检测结果

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后得到片段大小约为1450bp左右的清晰条带(图2)，与预期结果一致。

图2 恒河猴线粒体DNA控制区及其两侧部分序列的PCR产物注：M.分子量标准DL2000；1～9.样品编号Fig.2 PCR products of mtDNA control region and its flanking sequences in Macaca mulatta.Note：M.DNA marker DL2000；1～9.number of samples

2.2 单倍型分布

PCR扩增产物测序后，利用BLAST和GenBank中的恒河猴线粒体序列进行比较，同源性达到91.5%以上，说明该序列即为目的基因。经DNA SP软件分析，所有96个序列定义了46个不同的单倍型(H1-H46)，各单倍型在不同种群中的分布情况见表1。有7个单倍型(H1、H5、H13、H25、H26、H27、H28)为部分群体间共享的单倍型，单倍型H1为镇沅、景东、维西三个群体共享，单倍型H5为镇沅和昆明自繁群体共享，单倍型H13为镇沅和景东群体共享，单倍型H25为保山和昆明自繁群体共享，单倍型H26为镇沅和景东群体共享，单倍型H27、H28为宁蒗和昆明自繁群体共享，其余均为各群体特有单倍型。镇沅群体以H1(6/21)和H13(4/21)为主要单倍型，景东群体以 H26(5/21)、H13(3/21)和H29(4/21)为主要单倍型，宁蒗群体以H11(3/24)、H18(7/24)、H27(4/24)和H28(4/24)为主要单倍型，昆明自繁群体以H22(5/22)和H37(3/22)为主要单倍型。

以本研究测定的单倍型H1为参考序列，在96份样品中，共检测出了149个多态性位点(变异位点分布情况见图3)，约占13.70%。其中单一多态位点42个，约占3.86%；简约信息位点107个，约占9.84%。两核苷酸间的单一多态位点为41个，约占3.77%；两核苷酸间的简约信息位点为105个，约占9.66%。三核苷酸间的单一多态位点为1个，约占0.09%；三核苷酸间的简约信息位点为2个，约占0.18%。核苷酸变异包括转换、颠换、插入和缺失，所有核苷酸多态位点主要以转换为主。

表1 46个单倍型在云南地区不同恒河猴群体中的分布Tab.1 Distribution of 46haplotypes in different Macaca mulatta populations in Yunnan province

2.3 云南地区恒河猴遗传多样性

经DNA SP软件分析，云南地区96份恒河猴样品线粒体DNA控制区核苷酸序列共定义了46种单倍型，单倍型多样度(Hd)为0.955±0.015，核苷酸多样度(Pi)为0.020。各群体内单倍型多样度和核苷酸多样度等信息见表2。从该表中可以看出，云南地区不同恒河猴群体单倍型多样度在0.866± 0.042和 1.000±0.500之间，核苷酸多样度在0.003和0.042之间，平均核苷酸差异在3.000和60.000之间。变异位点数最多的是昆明自繁恒河猴群体(114个)，其次是景东恒河猴群体(75个)。简约信息位点数最多是昆明自繁群体(78个)，其次是宁蒗恒河猴群体(37个)。云南地区不同恒河猴群体Tajima's D中性检验均不显著(P ＞0.10)。

2.4 单倍型的系统进化关系

以食蟹猴为外群，借助 Mega软件采用 NJ和ME法构建了云南不同地理种群46个单倍型的系统发生树(图4)，各分支上的数值为1000次自举(bootstrap)分析得到的支持率。从图4中可以看出NJ树和ME树具有基本相同的拓扑结构，两者均表明所分析的序列分为两大分支，食蟹猴单独聚为一支，云南地区猕猴聚为另一支。所分析的云南地区猕猴分为两个平行的姐妹分支，来自不同地理位置的猕猴种群单倍型大多按照其来源地分别相对聚在一起，表现出了与地理位置一定的对应关系。其中单倍型 H36(牟定)、H30(牟定)、H42(昆明自繁)、H45(昆明自繁)、H33(景东)、H23(保山)和H41(昆明自繁)聚为第一分支，其他单倍型聚为第二分支。在第一分支中，除了景东来源的单倍型H33与其他单倍型没有直接血统关系外，保山来源的猕猴与牟定来源的猕猴相对聚在一起(根据个体档案记录可知，单倍型H42、H45具有牟定来源猕猴的血统，H41具有保山来源猕猴的血统)。第二分支中，来源于镇康的猕猴(H32)单独聚为一支，其它单倍型聚为一支。其中，来源与镇沅和景东猕猴相对聚在一起；宁蒗来源猕猴除了单倍型H18和H28外，其它单倍型均聚为一个亚分支(H11、H14、H15、H17、H27、H40、H44)。

表2 云南地区恒河猴群体内线粒体DNA控制区核苷酸序列多态性Tab.2 Nucleotide polymorphism of mtDNA control region within the Macaca mulatta population in Yunnan province

图4 基于线粒体DNA控制区构建的NJ(A)和ME(B)系统树Fig.4 Phylogenetic trees constructed using NJ(A)and ME(B)methods based on the complete sequences of mtDNA control region

3 讨论

恒河猴在我国《国家重点保护野生动物名录》中被列为国家二级保护动物，在《中国濒危动物红皮书兽类》中被列为易危种。而遗传多样性的高低是评判物种是否能够长期生存的依据，遗传多样性的丧失对物种生存带来直接的不利影响，可以使物种更易灭绝［9］。因此，对恒河猴遗传资源进行保护及合理开发利用显得非常的重要。许多学者从蛋白质水平对中国恒河猴进行了分析，结果表明中国恒河猴在蛋白质水平上的遗传标记数量有限、变异不够丰富、多态性有局限。目前认为DNA分析是最有效的遗传多样性分析方法，中国恒河猴DNA分子水平的遗传多态性主要见于对主要组织相容性复合体(MHC)、微卫星座位及线粒体 DNA的研究［10-14］，研究结果表明中国恒河猴表现出了丰富的遗传多样性。

本研究从分子水平研究了云南地区恒河猴遗传多样性，在96个恒河猴个体中，共检测出了149个多态性位点，定义了46种单倍型，其中仅有7个单倍型为部分群体间共享，其余均为各群体特有单倍型。各群体的核苷酸多样度(Pi)均较高，从0.003(牟定)至0.055(保山)，说明云南地区恒河猴遗传多态性较高，遗传资源较丰富。此外，云南地区不同恒河猴群体Tajima's D中性检验均不显著(P＞0.10)，这些群体均符合中性突变，说明云南地区恒河猴在过去没有出现群体扩张，群体大小较稳定。

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