沈伟敏 陆 贝 封光华

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)胰外器官损伤中急性肝肾功能损害较常见，常并发多器官功能不全综合征(MODS)。近年国内外研究资料表明，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell， MSC)可参与多种组织器官损伤的修复。本研究用静脉移植和骨髓动员两种途径观察MSC对SAP大鼠病死率、炎症介质、肝肾细胞功能及凋亡的影响，推测相关机制。

材料与方法

1.材料:240只雄性SD大鼠，体重270～330g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。L－精氨酸、戊巴比妥钠购自Sigma公司，Bax、Bcl－2抗体购自Santa公司，TUNEL试剂盒购自Takara公司，粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating Factor，G－CSF)购自齐鲁制药有限公司。

2.方法:(1)实验分组与建模方法:240只SD大鼠按随机数字表法进入对照组、SAP模型组、MSC组、G－CSF组及MSC +G－CSF组，各组再按SAP后12、24、48、72h随机分为4个亚组。大鼠禁食12h，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(0.2ml/ 100g)，麻醉成功后建立股静脉通道，间隔1h腹腔注射20g/L的L－精氨酸2.0g/kg两次。MSC组制模SAP成功后6h股静脉注入自体MSC液1.2ml，G－CSF提前3天注射G－CSF液40μg/(kg·d)，MSC+G－CSF组兼使用MSC和G－CSF液，对照组腹腔注射等体积生理盐水。MSC采集:股骨穿刺抽取骨髓，1000r/min离心10min，PBS液离心3次，细胞沉淀液2500r/min离心30min，收集单核细胞层，PBS洗涤2次铺板培养，与造血细胞分离［1］。(2)病死率及肝、肾病理变化:观察各组对应时间的病死率(死亡数/总数×100%)。解剖观察大鼠肝脏和肾脏大体及光镜下的病理改变。(3)血清肝肾功能ALT、AST、Bun、Cr、LDH和炎症因子TNF－α、IL－6、CRP水平的检测:由全自动生化分析仪操作完成，具体操作参照试剂盒说明书。(4)肝肾细胞凋亡指数:对肝脏和肾小管切片行TUNEL染色，400倍镜下观察凋亡细胞的分布，计算凋亡指数AI(视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%)。……