杨锦红 刘 洋 王新林 李方去 陶洪群 李向阳

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，S.p)在世界范围内仍然是一种重要的病原体，可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎及菌血症等多种严重疾病［1，2］。对肺炎链球菌的诊断，目前主要依赖传统方法——培养法进行检测，但是培养法需要对微生物分离、培养和鉴定等检测存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，对临床快速诊断，尤其是侵袭性感染的诊断不及时，造成临床治疗上的延误。随着分子生物学技术的发展，肺炎链球菌的快速诊断研究进展迅速，其中有环介导等温核酸扩增技术(LAMP)、PCR检测核糖体(16SrRNA)、BOX－PCR、荧光定量PCR、免疫层析法、DNA探针杂交等，从基因/基因组的层面对肺炎链球菌进行快速诊断［3，4］。

材料与方法

1.菌株来源:2010年3～6月在温州医学院附属第二医院住院患儿送检的呼吸道、血液及脑脊液标本分离的非重复的20株肺炎链球菌。质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619。

2.仪器:Microscan Walkaway－90SI型全自动细菌鉴定仪(德国西门子公司)、PCR仪(德国Eppendorf公司产品)、电泳仪(美国BIO.RAD公司)、凝胶成像系统(北京六一公司)

3.试剂:PCR试剂和DNA MarkerⅠ购于TaKaRa大连宝生物公司，引物参照文献设计［5］，由上海生工生物技术有限公司合成。限制性内切酶EcoRⅠ、MseⅠ购自Fermentas公司，DNA分子质量对照购自MBI公司。EcoRⅠ接头、MseⅠ接头、引物序列见表1。

4.菌种鉴定及药敏试验:挑选血平板上脐窝状的可疑菌落分纯，同时做奥普托欣(Optochin)试验，再用 Microscan Walkaway－90SI型全自动细菌鉴定仪鉴定及药敏试验，判断标准参照CLSI(2010版)标准。

5.AFLP实验:根据张顺等［6］报道的方法改进后用于实验。(1)基因组DNA的……