张世阳，高海青

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院老年病科，合肥230001;2.山东大学齐鲁医院老年病科、山东省心血管病蛋白质组学重点实验室)

人类基因组工作框架图的完成，标志着生命科学的研究进入后基因组时代。研究的重点从作为遗传信息的载体—基因，逐渐转向生理活动的执行者—蛋白质。人们认识到，只有对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系以及其生物功能的全面了解，才能阐明生命活动的规律，揭示生命现象的本质。蛋白质组学这一新兴学科应运而生［1］。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)最常见与最严重的并发症之一，也是目前世界范围内主要致盲原因之一。蛋白质组学的兴起为DR的研究提供了崭新的途径，可以帮助阐明DR的发病机制、筛选特异性生物标志物与寻找药物靶标等。因此，蛋白质组学在DR的研究中越来越受到重视。

1 蛋白质组与蛋白质组学的概念

1994 年澳大利亚学者 Wilkins与 Williams［2］首先提出了蛋白质组(proteome)的概念。这是由英文蛋白质(protein)与基因组(genome)组合而成的新的英文名词。自此之后，蛋白质组成为生命科学研究的新领域。

蛋白质组是指一个细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学则为一衍生概念，是从整体的角度分析细胞或组织的动态变化的蛋白质组成成分、表达水平、翻译后修饰状态以及蛋白质之间的相互作用，揭示蛋白质功能与细胞生命活动的规律，进而了解疾病的发生与发展。

2 蛋白质组学的研究内容

目前蛋白质组学的研究内容主要分为两部分，一是表达蛋白质学，为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。如我国科学家团队于2002年率先组织实施的“人类肝脏蛋白质组计划”。这种蛋白质表达法研究大规模化、系统化，理论上符合蛋白质组学的本质，但实际操作中由于蛋白质的动态变化，实现目标往往比较困难。二是差异蛋白质学，为“功能法”，即研究不同时间与空间下细胞蛋白质组成的变化，以发现有差异的蛋白质组学种类为主要目标，其特点在于其更高的可行性，并且反映了蛋白质的动态本质，因此具有广泛和明确的应用前景。近年来蛋白质组学的研究范围也在不断的完整与补充，如修饰蛋白质学、定量蛋白质学等。

3 糖尿病视网膜病变的蛋白质组学研究

DR是DM最为常见的慢性并发症之一，是目前主要致盲眼病之一。资料显示［3］，我国DM患者中DR患病率为25.2%，而且初次诊断的2型DM患者中DR患病高达12.4%。传统的研究手段已经初步揭示了DR的病因与发病机制，但仍缺乏对其复杂的分子机制的认识，限制了DR诊治水平的提高。蛋白质组学的兴起为探讨DR的病理生理机制以及新药开发提供了广阔的平台，为DR的临床诊治上带来崭新的视角与手段。目前蛋白质组学已经应用于DR病变这一领域并取得一定的成果。

3.1 蛋白质组学在DR相关的体外培养细胞的应用 人视网膜色素上皮细胞(RPE)的迁移、去分化以及增殖在DR病变中具有重要作用，成为近年来研究DR等眼底病变的切入点之一。West等［4］将人RPE细胞制备成亚细胞标本，利用蛋白质组学技术首次对人RPE细胞蛋白质组进行分析，共分离检测得到278种蛋白质，大部分为管家蛋白，另外包括细胞视黄醛结合蛋白、细胞视黄醛连接蛋白、光间受体视黄类结合蛋白等以及与视觉功能相关的蛋白。Alge等［5］运用2-DE/MS研究了自然分化的RPE细胞以及体外培养去分化的RPE细胞的差异蛋白质，结果显示在培养的去分化RPE细胞中吞噬功能蛋白如网格蛋白、组织蛋白酶D等并未变化，但与细胞形状等形成蛋白如细胞角蛋白19、肌动蛋白以及肌凝蛋白表达上调，与细胞增殖有关蛋白如翻译起始因子、钙依赖蛋白也有所上调，而与RPE细胞视觉功能相关蛋白如细胞视黄醛结合蛋白、细胞视黄醛连接蛋白表达则明显下调，提示RPE细胞的体外去分化可能触动了视网膜病变的发生。在直接研究DM患者RPE蛋白质组学上，新近有学者作了有益的尝试。Decanini等［6］分离了无 DR临床症状的DM患者的RPE细胞，应用2-DE联合MALDI-TOF/MS技术，并与年龄匹配捐助眼来源RPE细胞比较，共发现31种差异蛋白质，鉴定出18个差异蛋白，其中15个表达上调，3个表达下调。差异蛋白功能主要涉及能量代谢与伴侣蛋白，另外包括有脂质氧化、细胞骨架、视网膜代谢以及运输合成蛋白等，考虑到RPE细胞在视网膜疾病中的重要性，该实验结论有助于进一步探索与揭示早期DR的病理机制。

3.2 蛋白质组学在DR动物模型中的应用

3.2.1 DR 动物模型蛋白质组的变化 Liu 等［7］使用2-DE技术比较了8周DM大鼠视网膜与正常SD大鼠视网膜蛋白质的变化，共检测出DM大鼠视网膜36个差异蛋白，其中5个蛋白上调，23个下调，8个点消失。尽管作者未运用具体的蛋白质鉴定技术进行进一步探索，仍为国内开展蛋白质组学在DR中的研究作出了努力。王亚冬等［8］用高脂饮食联合小剂量链脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠2型DM模型，利用2-DE技术分离DM视网膜，与正常组比较，表达明显差异的约150个蛋白质，上调点68个，下调点82个。他们进一步应用 MALDITOF/MS与串联质谱(MS/MS)鉴定发现10个为新发现蛋白，其功能涉及糖脂代谢、炎性反应、NO合成酶途径以及细胞骨架蛋白与分子伴侣蛋白等，随后采用蛋白印迹技术验证了其中αA晶体蛋白，提示其在DM视网膜上明显表达上调。

3.2.2 药物干预对DR动物模型蛋白质组的影响目前观点认为［9］，差异表达的蛋白很有可能参与了DR的发生发展，而应用药物干预后能够回调的蛋白则具有巨大的临床实用价值，可以作为DR的分子标记，以及作为今后治疗和设计更为有效的药物靶标。国内高海青课题组率先开展了此方面研究，并取得了重大成果。他们选择天然药物葡萄籽原花青素提取物(GSPE)治疗DM大鼠并进行蛋白质组学研究，结果发现，与DM模型组比较，GSPE干预组7个蛋白回调至正常水平，分别是αB-晶状体蛋白、βA4-晶状体蛋白、αA-晶状体蛋白、泛素羧基末端水解酶-L1、G蛋白-β1、IgG-2A与丙酮酸激酶。该研究提示晶状体蛋白的高表达参与了DR的发生与发展，GSPE干预的抑制作用可能减缓DR的进展;而泛素羧基末端水解酶-L1、G 蛋白-β1、IgG-2A与丙酮酸激酶在DM视网膜表达下调，其功能涉及细胞周期调控、细胞增殖、跨膜信号转导、氧化应激等，GSPE干预的恢复作用有助于 DR的改善［10］。Gao等［11］应用血管紧张素受体Ⅰ拮抗剂坎地沙坦干预STZ诱导建立的DM小鼠模型，利用LC-MS/MS技术比较干预前后蛋白质组学变化，结果发现与非DM组比较，DM小鼠视网膜组有65个蛋白质发生2倍以上的改变，其中的72%经过坎地沙坦干预后可以回调。这些蛋白与代谢、氧化应激以及凋亡等功能有关，并可能参与DR的发展，而血管紧张素受体Ⅰ拮抗剂坎地沙坦可能有助于DR的治疗。胰岛素是治疗糖尿病的重要药物之一，研究胰岛素治疗前后蛋白质组的变化有利于真实世界中从蛋白质水平上深入理解DR的病理生理机制。新近VanGuider等［12］同时采用多种蛋白质组学技术(抗体Luminex、DIGE与 LS-MS/iTRAQ)研究 DM 大鼠视网膜病变蛋白质的变化，并使用胰岛素干预，结果提示，干预后地西泮结合抑制蛋白、膜联蛋白5等蛋白恢复正常，而血浆铜蓝蛋白、晶状体蛋白β3、可溶性半乳糖苷结合凝集素3以及信号转导子和转录激活子3等蛋白部分恢复正常，成纤维细胞生长因子2与晶状体蛋白β2的上调则未受任何影响。作者认为，胰岛素干预后未能回调至正常的蛋白可能在DR发病机制的“代谢记忆”中发挥作用，并为DR的治疗药物的选择提供了全新思路。

3.3 蛋白质组学在DR患者中的应用

3.3.1 DR患者玻璃体液蛋白质组研究 玻璃体与视网膜结构密切，眼底视网膜的病变往往反应于玻璃体液的改变，同时玻璃体液的取材技术方便，目前玻璃体液成为了研究DR患者蛋白质组学的主要研究对象。

Bresgen等［13］开始利用2-DE分析增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)患者的玻璃体蛋白成分与正常人玻璃体以及血清蛋白的不同。研究结果显示，正常的玻璃体内最常见的蛋白质为白蛋白、转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白与前清蛋白等。PDR玻璃体样本中，转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶与前清蛋白的含量下降，而免疫球蛋白水平升高，更类似于血清蛋白的构成，提示PDR已经发生血-视网膜屏障的破坏。另外，新发现3种低分子量蛋白只出现在PDR玻璃体中，分析可能为玻璃体视网膜的增生反应导致的局部蛋白质的异常额外合成。随着蛋白质组学技术的进步与完善，DR的功能蛋白质组也有了更多的发现。Gao等［14］利用 SDS-PAGE与LC-MS/MS技术比较了PDR的蛋白质变化，结果显示，与DM患者但无视网膜病变者(NDR)比较，PDR患者玻璃体液中血管紧张原表达升高，而钙结合蛋白-1、光间受体视黄醛结合蛋白与神经丝氨酸抑制蛋白明显表达降低;与DM患者但无视网膜病变者以及非DM患者相比，PDR患者玻璃体液中氧化还原修饰酶-1表达增加，超氧化物歧化酶水平降低。该研究进一步开拓了对于DR特别是PDR的发病机制的理解。

由于黄斑裂孔(MH)病变影响玻璃体液的蛋白质成分可能性小，而且取样更符合伦理学原则，因此目前研究中MH往往作为DR蛋白质组学研究的对照组。Nakanishi等［15］运用2-DE与MS分析比较了DR和MH患者玻璃体内可溶性蛋白的不同。共检测出52种不同的蛋白。与MH患者相比，DR患者玻璃体中免疫球蛋白、α1-胰蛋白酶、α2-硫酸肝素糖蛋白与补体C4等蛋白丰度表达增高。同时在DR患者玻璃体中检出色素上皮源性因子(PEGF)。作者认为，这种强有力的新生血管抑制因子PEGF出现在以增生性新生血管为特征的DR患者玻璃体中，是否代表着玻璃体微环境平衡打破后的自身代偿与恢复机制，而能否将其当作增生性DR治疗的又一方向，尚待进一步探讨。随后Yamane等［16］分别将DR与MH患者的玻璃体与各自相对应的血清进行蛋白质成分比较，发现烯醇化酶与过氧化氢酶在DR患者血清中未检出，在MH玻璃体中为阴性，仅仅出现于DR患者的玻璃体中，提示两者与DR的发生相关。新近Garcia-Rameriez等［17］应用DIGE技术分析PDR患者与MH患者的蛋白质差异。共检出差异蛋白点41个，其中28个上调，13个下调。共鉴定出11种蛋白，其中上调蛋白8种，分别为锌α2-糖蛋白、载脂蛋白A-I、载脂蛋白H、纤维蛋白原A、补体 C3，C4b，C9以及补体因子 B;下调蛋白3种，则是色素上皮衍生因子、间质性视黄醇结合蛋白与α胰蛋白酶抑制剂重链前体。作者并且采用蛋白印迹以及实时PCR技术验证了锌α2-糖蛋白、补体C3、补体因子B、色素上皮衍生因子与间质性视黄醇结合蛋白。这些蛋白与抑制细胞增殖、激活补体系统、新生血管形成以及视色素的再生等有关，参与了DR的病理机制。该课题组还作了进一步研究［18］，结果显示，光间受体视黄醛结合蛋白在 DR早期阶段明显下调，其与视网膜神经变性有关;而载脂蛋白A-I与载脂蛋白H则在PDR患者中明显上调，前者可能有抗氧化应激作用，后者可能有防止细胞凋亡功能。

3.3.2 DR 患者视网膜蛋白质组研究 Ann 等［19］应用免疫印迹方法分析PDR患者、NPDR患者、DM患者与正常对照者血清以及正常对照者视网膜可溶性蛋白质的变化，并采用2-DE和ESI-MS/MS进行鉴定，继而运用兔醛缩酶进行免疫印迹检测以筛选DR的自身血清抗体，并以ELISA检测抗体滴度。结果证实，与DR患者血清反应的20个蛋白点，其中14个蛋白点只发现于DR患者血清，4个蛋白点在PDR患者与NPDR患者血清中均存在。研究还显示，DR血清中的确存在一种抗醛缩酶-C抗体高表达，其滴度显著高于正常对照者以及未发生视网膜病变的DM患者，但PDR患者与NPDR患者中抗醛缩酶-C抗体滴度无显著差异。作者分析，基于醛缩酶-C只出现于脑部在神经元表达，其自身抗体出现说明DR患者血-视网膜屏障的破坏，提示抗醛缩酶-C抗体可作为一种DR的诊断性标记物进行临床检测。该研究提出了自身免疫机制可能也参与了DR的病理过程，拓宽了DR研究的新观点。

4 小结

综上所述，通过蛋白质组学方法在DM研究中的应用，已部分揭示了DR的病理生理机制，发现了一些与DR的相关蛋白，展示了蛋白质组学技术在DR研究中的应用前景。相信随着蛋白质组学技术的不断进步，势必更加完善DR发病机制的诠释，更好地诊治DR。

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