鲁华 林海英

肾小管间质纤维化(RIF)常被视为衡量肾脏病慢性进展的重要指标之一。在这一过程中肾小管上皮细胞转分化(EMT)发挥着决定性作用，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscular actin，α-SMA)是发生 EMT 的重要标志［1］。许多研究证实，阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)能够在一定程度上延缓肾间质纤维化，但其究竟通过哪种途径发挥作用尚不明确［2－6］。本实验通过观察肾小管上皮细胞磷酸化p38MAPK、TGF-β1、α-SMA的表达情况，研究SF对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠的肾脏保护作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SPF级雄性SD大鼠60只(购自河北医科大学试验动物中心)，体重180～220 g。实验开始前适应性饲养1周，自由进食。

1.2 药物与试剂 SF片(山东丽珠制药有限公司);兔抗鼠磷酸化p38单克隆抗体;兔抗鼠α-SMA单克隆抗体;兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体;SP9000试剂盒、APES(粘合剂)、DAB(二氨基联苯胺)、DAB显色试剂(均购自北京中山生物有限公司)。尿NAG酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 仪器 普通光学显微镜、石蜡切片机、超薄切片机、彩色病理图文报告分析仪、包埋机、烤片机、冰箱、加样器、载玻片及全自动生化仪。

1.4 动物模型制作、分组 将健康雄性SD大鼠60只随机分为假手术组(A组)，UUO模型组(B组)和SF组(C组)，每组20只。所有大鼠经2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，A组开腹、分离左侧输尿管后不结扎，分层缝合;B组、C组于左侧输尿管中上1/3处结扎并剪断，逐层缝合。术后1 d起，C组给予 SF(SF片 溶 于 0.9% 氯 化 钠 溶 液 中)，以110 mg· kg－1·d－1灌胃，A、B 组仅以 0.9% 氯化钠溶液灌胃(2 ml/d)作为对照，均持续2周。实验期间大鼠自由进食。各组大鼠于术后第14天处死前用代谢笼收集晨尿，于－20℃贮存备用。断头处死后，取梗阻侧肾脏，沿冠状面纵行剖开，置于4%多聚甲醛溶液中固定;同时心脏取血备检。

1.5 组织学处理 所有标本按常规实验方法固定、包埋，组织切片厚2 μm，作HE、Masson染色，光镜观察病理变化。

1.6 免疫组织化学染色 采用SP法。石蜡包埋的切片常规脱蜡至水，3%H2O2处理，抗原热修复，正常山羊血清封闭后，滴加鼠抗PCNA单抗(1∶100)4℃孵育过夜。滴加Ⅱ抗，显微镜下控制DAB显色，苏木素复染。同时采用PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。结果评估:每例分别随机选取10个高倍视野(×200倍)，运用彩色病理图文报告分析仪对选取视野内阳性信号进行图像分析，测定肾小管上皮细胞中TGF-β1、p-p38、以及α-SMA的阳性表达面积占肾小管间质总面积的百分比，并取平均数(平均面密度)，即分别得出以上三项指标的表达均值并作比较。

1.7 实验室检查 应用自动生化仪检测3组大鼠血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)及尿NAG酶活性。

1.8 统计学分析应用SAS 9.1统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学改变 HE染色显示A组大鼠肾脏未见明显病理改变;B组可见肾间质水肿，散在炎细胞浸润，出现间质纤维化;Masson染色显示胶原显著增多，皮髓交界处纤维化程度明显。与B组相比，C组的肾脏病理改变较轻。见图1。

2.2 免疫组织化学染色结果 A组大鼠肾皮-髓质交界区仅有少量TGF-β1的表达，p38主要定位于肾小管上皮细胞的胞核及胞浆，α-SMA在A组肾小管上皮细胞几乎无表达。B组TGF-β1、p-p38和 α-SMA 表达量明显高于 A 组(P=0.028)，而C组大鼠梗阻肾组织TGF-β1、p-p38、α-SMA各时间点表达量较B组明显减少，组间差异均有统计学意义(P=0.043)。见表1，图1 ～4。

表1 术后14 d 3组大鼠免疫组化指标检测结果 n=20，±s

表1 术后14 d 3组大鼠免疫组化指标检测结果 n=20，±s

注:与 A 组比较，*P ＜0.05;与 B 组比较，#P ＜0.05

组别 α-SMA p38 TGF-β1 A组0.0132 ±0.0014 0.0029 ±0.0035 0.0146 ±0.0032 B 组 0.1674 ±0.0150* 0.1636 ±0.01776* 0.0898 ±0.0211*C 组 0.1357 ±0.0124*#0.1238 ±0.0125*# 0.0660 ±0.0122*#

图1 术后14 d 3组大鼠梗阻肾组织病理改变(HE×200)

图2 术后14 d 3组大鼠梗阻肾组织TGF-β1表达情况(HE×200)

图3 术后14 d 3组大鼠梗阻肾组织p-p38表达情况(HE×200)

图4 术后14 d 3组大鼠梗阻肾组织α-SMA表达情况(HE×200)

2.3 生化结果 给药14 d后，与A组相比，B组大鼠尿NAG酶活性明显升高(P=0.029);而与B组比较，C组大鼠尿NAG酶活性明显降低(P=0.044)。B组Scr及BUN水平均高于A组(P=0.026)，而C组大鼠Scr及BUN水平较B组明显降低(P=0.048)。见表2。

表2 3组术后14天各组大鼠生化指标检测结果 n=20，x¯±s

3 讨论

多种慢性肾脏疾病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路是肾间质纤维化［1］，其机制仍未完全明了。SD大鼠的UUO模型是一种研究肾纤维化发生机制和评价药物疗效的理想模型。肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT)是最重要的致纤维化机制之一，肾小管上皮细胞胞浆内出现大量α-SMA是EMT发生的重要标志。本实验成功建立了UUO模型，2周后结扎侧肾间质普遍可见弥漫性炎细胞浸润，肾小管明显扩张及纤维化病变;同时应用免疫组化法检测到肾小管上皮细胞α-SMA的表达显著增加，验证了EMT在致纤维化过程中的重要作用，并与陈静等［7，8］的研究结果相同。术后2周，可见模型组大鼠尿NAG酶活性、血尿素氮及血肌酐均明显升高(P ＜0.05)，与相关文献报道［9］结果相同。

TGF-β1是最关键的促纤维化生长因子，参与肾小管上皮细胞表型转化，在梗阻性肾病发展过程中发挥重要作用［10，11］。本实验发现TGF-β1在UUO术后表达明显增加，且与肾脏病理损害程度呈正相关，与左川［12］等的研究结果一致。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated proteinase kinase，MAPK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内主要的信号转导系统。MAPK超家族成员之一p38MAPK是细胞信息传递的共同通路。紫外线、促炎细胞因子、应激等因素均可激活p38MAPK，即苏氨酸(Threonin，T)和酪氨酸(Tyrosin，T)双位点同时被磷酸化成为活化的 p-p38。Stambe等［13］发现，p38MAPK 作为TGF-β1发挥作用的通路之一，在 RIF中发挥重要作用。p38MAPK信号通路可能参与了UUO大鼠肾间质纤维化过程［14］，而阻断p38通路可抑制α-SMA的表达，提示p38通路是介导EMT的重要细胞内信号转导途径之一［15］。张新志等［16］研究指出，在UUO模型中，肾小管上皮细胞p38MAPK被激活，可能介导TGF-β1表达;高表达的TGF-β1可能维持p38MAPK的活化，促进肾间质纤维化形成。本实验也证实了p38MAPK与TGF-β1存在明显相互作用。本研究观察到，UUO模型肾组织TGF-β1的表达明显增高，与p-p38、α-SMA的表达变化趋势一致，与文献报道相一致。故我们指出，TGF-β1/p38MAPK通路可能在促肾小管上皮细胞转分化，导致肾间质纤维化过程中起了十分关键的作用。

SF普遍存在于当归、川芎等植物中，是活血化瘀的主要活性成分之一。SF即3-甲氧基-4-羟基-苯丙烯酸钠，是阿魏酸的钠盐，属非肽类内皮素受体拮抗剂。Stambe等［13］证实，SF能够对抗由TGF-β1引起肝纤维化。有研究也发现，SF呈剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化［4］。在UUO大鼠模型中，SF能否影响 TGF-β1、p-p38、α-SMA 的表达，从而延缓肾间质纤维化，目前尚未见报道。本实验观察到，SF可明显减少 TGF-β1、p-p38和 α-SMA的表达，抑制 EMT，发挥肾保护作用。尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosa minidase，NAG)存在于近端肾小管细胞的溶酶中，尿中NAG基本上都来自于肾组织，各种肾毒引起肾损伤都可以引起尿中NAG水平增高。本实验观察到，与A组相比，UUO术后B组尿NAG酶活性明显升高，而C组尿NAG酶活性、Scr、BUN值较B组显著下降下降，提示SF对UUO大鼠肾脏具有明显保护作用。

本实验成功制作了UUO模型，印证了肾小管上皮细胞转分化在肾间质纤维化过程中的决定性作用。观察到TGF-β1、p38MAPK及α-SMA在肾小管上皮细胞的表达变化，以及肾功能、肾小管损伤指标变化，得出:SF可能通过抑制 TGF-β1、pp38表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，起到延缓肾间质纤维化、保护肾脏的作用。

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