林婷婷，卢瑛，潘迎捷

(上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，为革兰阳性菌，需氧或兼性厌氧细菌。该细菌可以在一个很宽的温度范围内生长(1～45℃)，存在潜在的危险，特别是在冷藏食品当中［1］。单增李斯特菌广泛分布于水、油、蔬菜、肉类，甚至即食食品当中，受感染的人群临床主要表现为败血症、脑膜炎等［2］。近年来，已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌引起的食品中毒事件［3］。侧向流免疫层析(LFIA，Lateral flow immunoassay)是酶联免疫吸附反应(ELISA)技术原理的扩展应用［4］。目前对于LFIA的研究，主要针对以胶体金为标记物的研究，且在胶体金为标记物的基础上探讨化学物质对假阳性的影响［5］，以提高检测的准确性，即减弱背景值对检测的影响［6］，例如表面活性剂、蛋白质等［7］，同时，离子的浓度也对检测结果产生影响［8］。磁性免疫层析技术以磁性纳米材料代替传统的标记物来进行免疫层析。近年来，已有人类免疫缺陷病毒(HIV)［9］，人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒等的研制［10］。胶体金试纸条灵敏、快速且特异性强的优点，使其得到了人们越来越多的关注，对于待测物可以实现定性和半定量的检测，然而磁性试纸条可以对检测信号进行定量的分析，使结果的判定更为精准、灵敏、客观，同时便于记录保存［11］，弥补了胶体金试纸条的不足。本文以纳米探针为标记物，以抗单增李斯特菌的多克隆抗体为捕捉抗体，构建双抗夹心模式层析试纸条。在层析体系中分别添加不同浓度的表面活性剂、盐离子、杂蛋白和糖类，探讨了层析体系对磁性试纸条层析的影响作用，达到减弱背景信号值，提高检测灵敏度的目的，并应用于单增李斯特菌的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

磁性分析仪(美国Magna Bioscience公司);磁力架(上海奥润微纳新材料科技有限公司);漩涡振荡器(海门其林贝尔仪器制造有限公司);Centrifuge 5417R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);抗单增李斯特菌的单克隆抗体和多克隆抗体为本实验室所有;单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19115)，200 nm羧基磁珠(美国Magna Bioscience公司);硝酸纤维素膜vivid 90(美国，PALL公司);吸水垫、样品垫、结合垫(上海捷宁有限公司);山羊抗小鼠二抗(上海有科生物科技有限公司);MES(2-吗啉乙磺酸)(Alafa公司);EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(美国，PIERCE公司);Tween-20、Triton X-100、氯化钠、氯化钾、牛血清白蛋白(BSA)、四硼酸钠、硼酸、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、BCA蛋白定量检测试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。实验用水均为去离子水，试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 磁性纳米探针的制备采用NHS/EDC化学偶联的方法，将单增李斯特菌的多克隆抗体与磁性纳米材料进行化学偶联。偶联包括活化、偶联、封闭和保存4个过程。以pH 5.0的MEST溶液(含0.05%Tween-20的MES缓冲液)作为活化缓冲液，洗涤磁珠3次，洗涤过程在磁力架上进行，然后加入5 μL EDC(0.5 g/mL)和10 μL NHS(0.25 g/mL)作为活化剂，室温反应30 min，洗涤磁珠3次。接着以pH 9.0的硼酸盐吐温缓冲液(简称BST，含0.05%Tween-20)作为偶联缓冲液，加入100 μg抗体偶联3 h。偶联结束后，洗涤磁珠3次，加入含有1%BSA(质量体积比)的BST溶液(简称BST-BSA)反应30 min，封闭残留的活化基团。封闭结束后，洗涤磁珠3次，把偶联好的磁珠保存在含有0.05%(质量体积比)NaN3的BST-BSA溶液中4℃中待用［12］。

1.2.2 检测试纸条的构建首先用喷膜仪将抗体喷点在硝酸纤维膜vivid 90上。以单增李斯特菌多克隆抗体作为捕获抗体，固定在T线区域，作为检测线，将山羊抗小鼠IgG固定在硝酸纤维素膜上的C线区域，作为质控线［13］。喷点完后先在37℃烘箱过夜。膜处理结束后，将样品垫、结合垫、包埋了T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次衔接在衬板上，然后使用透明的薄膜覆盖在硝酸纤维素膜上，再将组建好的体系剪裁成0.5 cm宽的检测试纸条［14］。

图1 试纸条的构造图Fig.1 The constitution of the test strip

1.2.3 检测流程层析缓冲液为硼酸盐缓冲液(简称BS，pH 7.4)，浓度为0.05 mol/L。阴性样本的检测直接使用BS缓冲液作为基础层析液，阳性样本在检测时，将单增李斯特菌离心重悬到BS中调整菌数到1×107cfu/mL，再用于检测，并将稀释的菌液涂布TSA平板，确保菌数无误。检测前，将4℃保存的制备好的纳米探针用磁珠悬浮液(含1%(质量体积比)蔗糖，1%(质量体积比)海藻糖的BST)2倍体积重悬，取6 μL与120 μL样本进行预孵育，室温混合反应10 min后，120 μL滴加到样品垫上，室温静置20 min后，肉眼观察检测结果并置于磁信号分析仪中进行磁信号的定量检测。

1.2.4 层析体系中各组分对层析结果的影响

背景值的干扰，产生假阳性的现象，会影响层析结果的定性判断，影响结果的准确性。因此，在层析体系中添加化学物质，分析其对层析的影响，以提高膜对纳米探针的特异性吸附和减弱非特异性的吸附至关重要。找出关键的参数以后，并在此基础上，调节混合体系，以获得最优的符合要求的层析体系。①表面活性剂的影响作用探讨:采用2种不同的表面活性剂:Triton-100和Tween-20，它们是胶体金层析反应中最为常见的表面活性剂［6］。在2种基本层析缓冲液中分别添加不同浓度的表面活性剂(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)，以BS缓冲液为阴性样本，以含1×107cfu/mL单增李斯特菌的BS缓冲液为阳性样本进行检测，分析其对层析结果的影响;②盐离子的影响作用探讨:采用2种不同的盐，分别为KCl和NaCl。它们是胶体金层析中常见的盐［6］，用以探讨其对信号值的影响。在基本层析缓冲液中分别添加不同浓度的盐(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)，以BS缓冲液为阴性样本，以含1×107cfu/mL单增李斯特菌的BS缓冲液为阳性样本进行检测，分析层析的结果;③杂蛋白的影响作用探讨:采用2种不同的蛋白质，分别是牛血清白蛋白(BSA)和脱脂奶粉(主要成分为酪蛋白)，它们是免疫检测使用的传统的封闭试剂［6］。在基本层析缓冲液中分别添加不同浓度的蛋白质(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)，以BS缓冲液为阴性样本，以含1×107cfu/mL单增李斯特菌的BS缓冲液为阳性样本进行检测，分析层析结果;④糖类的影响作用探讨:采用2种不同的糖类，分别是蔗糖和葡聚糖。在基本层析缓冲液中分别添加不同浓度的糖类(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)，以BS缓冲液为阴性样本，以含1×107cfu/mL单增李斯特菌的BS缓冲液为阳性样本进行检测，分析层析结果。

1.2.5 混合体系下单增李斯特菌的检测根据层析体系中各组分对层析结果的影响，选择S/N值较高的组分浓度，进行混合体系的优化，以提高检测的灵敏度和准确性。阴性样本以BS缓冲液为基础层析液，阳性样本将1×107cfu/mL单增李斯特菌离心重悬到BS缓冲液中作为基础层析液，进行检测，分析层析结果。

2 结果与分析

2.1 检测结果的判定

检测结果如图2所示，阳性结果T线和C线均可见，而阴性结果仅C线可见，T线处没有条带。检测时，若无C线，则试纸条存在问题，检测结果视为无效结果。本文以阳性样本与阴性样本在T线的磁信号(MAR)值的比值对检测结果进行评价，阳性样本的MAR值设为S，阴性样本的MAR值设为N。若样品的S/N≥2.1则其结果视为阳性，若样品的S/N＜2.1则其结果视为阴性。S/N值越大表示阳性反应越强。当条带的MAR＜50，肉眼不可见。

图2 检测结果的判定Fig.2 Evaluation of test results

2.2 层析体系各组分对层析的影响

2.2.1 表面活性剂对检测结果的影响磁性层析试纸条在没有添加表面活性的情况下，层析缓冲液不能带动磁珠向前层析，磁珠都阻塞在结合垫与硝酸纤维素膜的交界处，T和C线处都没有颜色，试纸条无效。当加入表面活性剂以后，磁性纳米探针可以顺利层析，说明加入表面活性剂后，提供毛细涌动力，有助于纳米探针在试纸条上的层析作用。对胶体金层析试纸条的研究显示，表面活性剂可以干扰疏水作用［15］，可以增加其毛细管涌动能力，因而能非常有效的释放检测试剂［16］。

表1 表面活性剂对T线信号值的影响Table 1 The influence of surfactants of T line magnetic signal

不同表面活性剂对层析的影响见表1。加入不同浓度的Tween-20和Triton X-100以后，试纸条的T线处MAR值小于50，肉眼不可见。层析过程虽然可以进行，但是试纸条的C线处没有出现肉眼可见的条带，因此，该试纸条为无效的试纸条。因为层析过程需要表面活性剂的参与才能进行，因此后续的实验采用含0.5%的Tween-20的BS缓冲液为基础缓冲液。

2.2.2 盐离子对检测结果的影响无机盐通过静电屏蔽和干扰疏水的相互作用来影响蛋白质分子间的相互作用［17］。低浓度的盐，表现为盐溶作用;浓度增高，则表现为盐析作用［18］。

表2 盐离子对T线信号值的影响Table 2 The influence of salt ions of T line magnetic signal

由表2可知，加入盐离子以后，C线出现肉眼可见的质控线，试纸条由无效试纸条变为有效的试纸条，因此层析体系中一定的离子浓度是必需的。阴性样本和阳性样本的T线的MAR值均低于50，肉眼不可见，但是S/N值有所提高，出现阳性的检测结果。

2.2.3 杂蛋白对检测结果的影响对胶体金的研究显示，蛋白主要通过封闭膜上的空白位置，减少膜对抗原的非特异性的结合。但是大量的蛋白封闭，可能会使膜的疏水性增强，并减弱重湿润的效果［6］。

表3 杂蛋白对T线信号值的影响Table 3 The influence of protein of T line magnetic signal

如表3所示，随着BSA浓度的增大，T线的MAR值在逐渐的升高，S/N值逐渐下降，在0.5%BSA浓度下，S/N值为5.2，为阳性检测结果;加入脱脂奶粉以后，阴性和阳性MAR值均小于50，肉眼不可见，不利于结果的定性观察，但是S/N值呈现先增大后变小的趋势，S/N值增大到10.6，为阳性的检测结果。

2.2.4 糖类对检测结果的影响根据胶体金的研究显示，糖类对层析的影响主要是增加体系的粘稠度，降低侧向流速，从而提高检测灵敏度［7］。

表4 糖类对T线信号值的影响Table 4 The influence of carbohydrate of T line magnetic signal

由表4可知，随着蔗糖浓度的增加，其磁信号值缓慢的增加，但S/N值小于2.1，均为阴性的检测结果。随着葡聚糖浓度的增加，显著提高了膜对纳米探针的吸附能力，但是S/N值＜2.1，为阴性的检测结果，因此这种吸附能力的提高是非特异性的吸附。

2.3 单增李斯特菌的检测结果

根据层析体系中各组分对检测结果的影响，调节混合的层析体系，以减弱背景值的干扰，同时提高反应的灵敏度。磁性试纸条的MAR值＜50的时候，肉眼不可见，因此阴性样本的MAR值应控制在50以内，且获得较高的S值，使S/N值增大。通过混合体系的优化，得出Tween-20、KCl、BSA和葡聚糖的混合体系可以获得较高的S值和肉眼不可见的N值，达到定性检测的标准。定性检测结果如图3所示，阴性样本仅C线出现条带，阳性样本出现C线和T线2个条带。定量检测数据如表5所示，阴性样本的T线MAR值为36.1，阳性样本的MAR值为403.0，S/N为12.0，为阳性的检测结果。

图3 单增李斯特菌的定性检测结果Fig.3 Qualitative test results for Listeria monocytogenes

表5 单增李斯特菌定量检测结果Table 5 Quantitative test results for Listeria monocytogenes

3 讨论

近年来，越来越多的胶体金试纸条投入到市场当中，应用于很多方面的快速检测，例如早早孕试纸条、大肠埃希菌O157快速检测试纸条、唾液酒精试纸条等。其灵敏、快速且特异性强的特点非常适用于现场的检测。目前，市售的试纸条大多是采用胶体金为标记物，可以实现定性和半定量的检测。对于胶体金标记物，结合在硝酸纤维素膜深处的捕获试剂无法产生信号。本研究采用磁性纳米材料替代了胶体金作为标记物，无论磁颗粒在膜中的位置如何，都可产生信号，通过磁性分析仪，在定性检测的同时实现定量的检测，弥补了胶体金试纸条的不足。

本研究对层析体系中化学试剂的优化均以胶体金试纸条为依据，探讨了化学物质对磁性试纸条的影响作用。试纸条体系的构建使用了多种试剂，各个试剂在某种程度上都存在互相影响。通过在体系中添加Tween-20、BSA、KCl和葡聚糖，并对其浓度进行调整，提高了磁性试纸条的灵敏度，并确保检测的准确性，可以用于单增李斯特菌的快速检测。本文研究对今后研发类似磁性试纸条检测技术具有重要参考价值。

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