王雪莲，卢岩，韦苇，杨雪，安春丽

(1.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学附属盛京医院院感科，辽宁沈阳110004;3.中国医科大学七年制，辽宁沈阳110001)

RNAi(RNA interference)技术是近年迅速发展起来的新型基因阻断技术，已经被广泛应用于包括人类免疫缺陷病毒［1-2］、乙型肝炎病毒［3-4］及人乳头瘤病毒(human papillamavirus，HPV)［5］等病毒的基因功能和病毒性疾病以及病毒相关肿瘤的基因治疗研究。与直接导入小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)和体外转录的siRNA相比，短发夹RNA(Short hairpin RNA，shRNA)表达载体更易导入细胞内，带有抗生素标记的shRNA表达载体经过筛选可建立稳定转染的细胞株，能够更长时间地抑制目的基因的表达。而且表达载体可在细胞内进行复制扩增，不需要直接操作RNA，较少量的shRNA表达载体就能产生良好的抑制效果。本研究前期试验结果证实了化学合成的siRNA可有效地抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达［6］，为了进一步长期而有效地抑制HPV18癌基因E6、E7表达，构建、鉴定了含RNA polⅢ的shRNA表达载体pHPV［7］，建立稳定转染表达载体的细胞株，观察此细胞株HPV E6、E7基因表达的变化，为建立以HPV癌基因为靶标的宫颈癌基因治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含RNA polⅢ的shRNA表达载体pHPV［7］(携带G418抗性和GFP标记，靶序列为基因组434～452和基因组287～305)、无关序列对照载体和宫颈癌Hela细胞株由本教研室保存;RPMI-1640、G418为美国Sigma公司产品;胎牛血清、胰蛋白酶购自北京中杉有限公司;梭华-SofastTM转染剂购自厦门太阳马生物工程有限公司;Trizol和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司;HPV18-E6、E7、β-actin抗体及二抗均购自Santa Cruz公司;HPV18-E6、E7、β-actin引物由大连宝生物公司合成，序列如下:HPV18 E6:上游引物:5'-AAG ATT TAT TTG TGG TGT-3'，下游引物:5'-GCT GGA TTC AAC GGT TTC-3';HPV18 E7:上游引物:5'-TAT GCA TGG ACC TAA GGC-3'，下游引物:5'-CAG CCA TTG TTG CTT ACT-3';β-actin:上游引物:5'-AAA TCG TGC GTG ACA TTA A-3'，下游引物:5'-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3'。

1.2 方法

1.2.1 Hela细胞常规培养传代用含10%血清的RPMI-1640常规培养Hela细胞。

1.2.2 表达载体pHPV转染细胞转染前18 h，每孔接种3×105Hela细胞。2 μg质粒载体稀释于100 μL不含血清和抗生素的RPMI-1640中，轻轻混匀。4.5 μL转染剂稀释于100 μL不含血清和抗生素的RPMI-1640中，轻轻混匀。100 μL转染剂稀释液滴加到载体稀释液中，一边滴加一边混匀。室温孵育20 min。200 μL转染剂/载体复合物加到每孔中并轻轻摇动，均匀混合。置37℃培养箱中培养。同时设阴性对照和无关序列对照组。

1.2.3 转染后阳性细胞的筛选转染后48 h，用含1 000 μg/mL G418的RPMI-1640筛选，2～4 d换液1次。G418筛选10～14 d后可见阳性克隆，挑取阳性克隆，转移至新的培养板中，继续G418(400 μg/mL)筛选扩大培养。倒置荧光显微镜下观察。取转染后细胞进行mRNA、蛋白检测分析。

1.2.4 细胞总RNA提取TRIZOL常规提取细胞总RNA。

1.2.5 RT-PCR检测细胞中HPV18 E6、E7 mRNA取RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系如下:RNase Free dH2O 7.5 μL、MgCl24 μL、10×RT-Buffer 2 μL、dNTP(各10 mmol/L)2 μL、RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、Random 9 mers(50 pmol/μL)1 μL、RNA 1 000 ng、AMV Reverse Transcriptase(5 U/μL)1 μL，总体积为20 μL。反应程序如下:30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。PCR反应体系如下:无菌双蒸水5 μL、5×PCR Buffer 5 μL、Ex Taq HS(5 U/μL)0.125 μL、E6、E7、β-actin上下游引物(2 μmoi/L)各2.5 μL、逆转录cDNA 5 μL，总体积为20 μL。反应程序如下:E6:94℃5 min，94℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃10 min。E7:94℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃10 min。β-actin:94℃5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30个循环，72℃10 min。取5 μL PCR产物加样至1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后，用分析软件进行条带灰度分析。

1.2.6 Western Blot检测细胞内HPV18 E6、E7蛋白的表达常规消化转染细胞，PBS洗2次，将细胞收集在EP管中，加入适量的预冷裂解液，冰上孵育15 min。超声(100～200 W)3 s，2次。4℃，12 000 r/min离心15 min。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。把样品调成相同浓度，沸水煮5 min。每道50 μg上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，30 mA转印4 h，将蛋白带转移至硝酸纤维素膜上。牛血清封闭液封闭过夜后，与1∶1 000稀释的一抗(羊抗HPV18-E6、E7、β-actin IgG抗体)共同孵育1 h。TTBS洗膜3次，5 min/次。再与1∶1 000倍稀释的磷酸酶标记二抗共同孵育1 h。TTBS洗膜3次后，将膜用蒸馏水漂洗干净，放入磷酸酶显色液中显色。硝酸纤维素膜上蛋白质条带用计算机采图，并用FLuor chem.V2.0分析软件进行灰度分析。

2 结果与分析

2.1 转染质粒阳性细胞的筛选结果

转染质粒的细胞在荧光光源下呈绿色荧光(图1)。

图1 倒置荧光显微镜下转染质粒Hela细胞Fig.1 Hela cells transfected recombinant plasmid under inverted microscope

2.2 pHPV对细胞内HPV E6、E7 mRNA的影响

RT-PCR扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示pHPV1实验组HPV E6扩增片段(196 bp)、E7扩增片段(332 bp)亮度低于阴性对照组和无关序列对照组;pHPV2实验组HPV E6扩增片段亮度低于阴性对照组和无关序列对照组，而HPV E7扩增片段与阴性对照组和无关序列对照组相比，没有明显降低;各组ACTIN扩增片段(473 bp)亮度基本一致(图2)。

计算机采图，灰度分析软件分析灰度，以阴性对照组E6、E7与ACTIN的灰度比为100%，其他各组灰度比与阴性对照组灰度比相比较。结果显示，无关序列组HPV E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的106%、101%;pHPV1实验组HPV E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的31%、38%;pHPV2实验组HPV E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的54%、77%。

图2 pHPV对细胞内HPV E6、E7 mRNA的影响Fig.2 The effect of pHPV on HPV E6，E7 mRNA

2.3 pHPV对Hela细胞内HPV E6、E7蛋白的影响

Western Blot结果显示，pHPV1实验组HPV E6、E7蛋白条带灰度低于阴性对照组和无关序列组;pHPV2实验组HPV E6蛋白条带灰度低于阴性对照组和无关序列组，HPV E7蛋白条带与阴性对照组和无关序列组相比，没有明显降低;各组ACTIN蛋白条带灰度基本一致(图3)。

图3 pHPV对细胞内HPV E6、E7蛋白的影响Fig.3 The effect of pHPV on HPV E6 protein

计算机采图，灰度分析软件分析灰度，以阴性对照组E6、E7与ACTIN的灰度比为100%，其他各组与阴性对照组相比较。结果显示，无关序列对照组HPV E6、E7蛋白含量分别为阴性对照组的106%、97%;pHPV1实验组HPV E6、E7蛋白含量分别为阴性对照组的37%、31%;pHPV2实验组HPV E6、E7蛋白含量分别为阴性对照组的52%、83%。

3 讨论

HPV18基因组包含2个启动子，P105是早期启动子，在E6 ORF上游，启动基因组早期基因的转录［8-9］。几乎所有的乳头瘤病毒转录产物为双顺反子或多顺反子［10］，包含多个外显子和内含子。其中HPV18 E6、E7基因的早期转录本premRNA为双顺反子mRNA，在E6 ORF有一个内含子。如内含子被剪切，则形成E6E7 mRNA，表达E6和E7蛋白。内含子的剪切破坏E6 ORF，使全长E6蛋白表达受阻［11-12］。

研究证实，在宫颈癌Caski及Hela细胞内，HPV E6E7 pre-mRNA存在不同位置和不同程度的剪切。其中，Hela细胞HPV18 E6E7 pre-mRNA在nt233 5'ss、nt416 3'ss剪切［13］。本研究分别针对E6外显子和内含子区域设计shRNA，靶序列分别为基因组434～452和基因组287～305，成功构建shRNA表达载体pHPV1、pHPV2，并获得了稳定转染的Hela细胞株，结果显示pHPV1可降低Hela细胞HPV E6、E7 mRNA水平，pHPV2仅明显降低细胞HPV E6 mRNA的水平，而对细胞内HPV E7 mRNA的影响较小。分析原因可能为针对外显子区域pHPV1不仅可降解全长的E6、E7 mRNA，而且也可降解内含子剪切后形成的E6、E7 mRNA。由于E6E7 mRNA没有内含子，因而针对内含子区域pHPV2只能降解全长的E6、E7 mRNA，对E6E7 mRNA没有影响。但Tang等［12］发现内含子特异siRNA219降解Hela细胞E6E7 mRNA，因而认为siRNA降解发生在核内RNA剪切之前，即pre-mRNA水平。本研究中针对内含子区域(基因组287～305)的pHPV2是否能够同样降解E6E7 mRNA尚需要进一步证实。

由于HPV18 E6 ORF的终止密码子与下游E7 ORF起始密码子之间只有8 nt的距离，核糖体终止E6 ORF后不足以使核糖体有效再起始E7 ORF的翻译，因而未剪切E6E7 mRNA主要形成的是E6蛋白，而不是E7。而剪切的E6、E7 mRNA由于内含子的剪切，阅读框架发生了改变，提前出现了终止密码子，因而增加了E6 ORF与E7 ORF的距离，使得核糖体有足够的距离再起始E7的翻译。最近Tang等［12］研究显示HPV16、18 E7蛋白主要是由剪切的E6E7 mRNA以翻译终止-再起始的方式翻译形成的。本研究结果显示，pHPV1可降低Hela细胞内的HPV E6及E7蛋白，分析原因为针对外显子区的pHPV1既可降解形成E6蛋白的E、6E7 mRNA，又可降解形成E6和E7蛋白的E6E7 mRNA，由于pHPV2不能降解形成E7蛋白的E6E7 mRNA，因而仅对E6蛋白有明显的降低，而对E7蛋白含量影响较小。

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