李 昀，王航宁，邵明瑜，张志峰

（中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东青岛266003）

生殖腺是两性生殖细胞产生和分化的场所，研究生殖腺发生可以更好地调控物种的繁殖性能，提高种质特性，开发和利用优异的品种资源。这无论在理论上还是人工繁殖及资源开发利用等实际应用中都具有重要的意义。

单环刺螠（Urechis unicinctus）俗称“海肠子”，隶属于螠虫动物门（Echiuroidea）、螠纲（Echiurida）、无管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urechidae）、刺螠属（Urechis），是无管螠目在我国沿海分布的唯一种类［1］，具有很高的经济食用价值和改良底质的能力［2］，是一类亟待进一步开发的海洋动物资源。然而目前人们对单环刺螠生殖腺是如何发生的、性腺的形态结构及发育特点尚不清楚，这大大地限制了人们对该物种繁殖生物学以及养殖开发的研究。本实验以幼螠和成体单环刺螠为材料，采用组织学和细胞学方法对单环刺螠生殖腺的发生，卵巢的结构及年周期发育进行了观察，旨在为单环刺螠生殖生物学及人工繁育提供基础资料。

1 材料和方法

实验用单环刺螠成体购自青岛市南山海产品市场，产地为莱州海区，体长10～20 cm，体质量100～300 g。每月取样1次，共70只。幼螠由本实验室培养获得。选择生殖期肾管饱满的雌、雄个体，解剖从肾管中获取成熟两性生殖细胞，人工受精（精、卵数量8∶1）。受精卵经3次洗卵后转入50 cm×30 cm×30 cm的培养箱中充气培养。水温为室温（16～20℃），p H 7.9±0.05，盐度29±1。48 h后每天早晚各1次投喂小球藻、金藻等单胞藻。体节幼虫后转入含沙泥底质的水缸中，底质厚6 cm，培养密度为0.2 ind／cm2。在Nikon E80i型显微镜下观察单环刺螠的发育，选取1～4 cm的幼螠用于组织学观察。

游离生殖细胞的获取：采用注射器穿透体壁抽取含有生殖细胞的体腔液，2 000 r／min离心，弃掉上层体腔液细胞，收集各期生殖母细胞，Nikon E80i显微镜下观察和拍照。

组织学观察：单环刺螠幼螠用饱和MgSO4麻醉后，Bouin’s固定液固定24 h；对于成熟个体，剪取其雌性个体尾部虫体，固定于Bouin’s溶液中24 h。酒精梯度脱水，石蜡包埋，美国AO轮式切片机连续切片，厚度5～7μm，H＆E染色，Nikon E80i显微镜下观察、测量和拍照。

2 结果

2.1 单环刺螠性腺的发生和卵巢的结构

作者最早在3.5 cm体长的单环刺螠幼螠尾部后肠外壁处的结缔组织中，发现了原始生殖细胞（Primodial germ cells，PGCs）样的细胞。这些细胞胞体较大，直径约4μm，核大而圆，核仁明显，胞质透明并呈弱嗜碱性；此期幼螠连续切片观察，PGCs数量接近10个，它们和周围的结缔组织一起构成了生殖腺原基（见图1－1，2）。发育至4 cm的幼螠，构成性腺原基的细胞进一步增殖，且生殖干细胞主要位于原基的外围，结缔组织被包围其中（见图1－3，4），性腺的基本结构已具备。此期生殖细胞处于性原细胞阶段，未见分化的生殖细胞产生。随着发育的进行，生殖腺进一步伸长，并通过肌束将性腺两端的结缔组织固着在后肠壁和体壁上。

图1 单环刺螠生殖腺的发生和卵巢结构的年周期变化Fig.1 Gonad genesis and ovary annual development of Urechis unicinctus

单环刺螠的卵巢极小，呈条带状，位于虫体尾部后肠处。生长期和成熟期的卵巢长度也仅有900μm左右，因此肉眼不易辨认。光镜下可见各期卵母细胞位于卵巢外周，同一发育时期的卵母细胞往往聚集成团，卵巢内部为疏松结缔组织，结构相对疏松，胶原纤维丰富，偶尔可见排列疏松的肌纤维分布；在卵巢两端形成发达的肌束。卵巢中的生殖细胞包括卵原细胞、小生长期卵母细胞、卵黄发生早期卵母细胞和卵黄发生时期的卵母细胞（见图1－10～15）。

2.2 卵巢年周期发育

通过对全年样品切片观察发现，单环刺螠一年中出现2个生殖期，一次发生在春季（大生殖期）的4月中下旬至5月底，持续时间可达50 d左右；另一次为秋季（小生殖期），发生于9月份，约持续30 d。根据卵巢的组织结构以及体腔液中生殖细胞的发育特点，将单环刺螠雌体的性腺发育周期划分为5个时期，即增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期。

2.2.1 增殖期 6月末～7月和11月～次年1月，卵巢长度为200～800μm，卵巢中仅见外周的卵原细胞成团分布。卵原细胞团的数量随着卵巢的发育逐渐增加，从卵巢的最大切面观察，可见每个细胞团的卵原细胞数量约为7～9个（见图1－10，11）。此阶段体腔液中游离的卵母细胞团数量很少，肾管萎缩（见图1－5）。

2.2.2 生长期 7月末～8月下旬和2月～4月初，卵巢长度为800～900μm，卵巢内可见卵原细胞和卵母细胞（见图1－12）。7月末～8月中旬和2～3月，卵母细胞团开始出现在卵巢中部的结缔组织中，但数量明显少于卵原细胞团的数量；8月中旬～8月下旬和3月下旬～4月初，卵巢中卵原细胞团数量逐渐减少，卵母细胞团数量迅速增多，并充满卵巢中部，成为此时期卵巢中主要生殖细胞；在这些卵母细胞团中，以小生长期和卵黄发生早期的卵母细胞团为主，卵黄发生时期的卵母细胞数量少，且单个分布；进一步可见此期由于卵母细胞团脱落，而使卵巢边缘不完整，部分结缔组织膜破裂。生长期个体的体腔液中卵母细胞团的数量迅速增加，进入8月中下旬和3月末后，细胞团的数量减少，而游离卵母细胞数量增多（见图1－6，7）。

2.2.3 成熟期 8月末～9月中旬和4月～5月初，卵巢长度为800μm左右，其结构组成与生长期末期相似，卵原细胞数量很少，卵巢中充满了卵母细胞，其中卵黄发生时期卵母细胞数量最多（见图1－13）。体腔液中主要以游离的卵母细胞为主，卵母细胞团较少（见图1－8）。此阶段肾管饱满，充满了大量的成熟卵子。

2.2.4 排放期 9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬，卵巢长度为600μm左右，卵巢中的生殖细胞骤减，主要为卵原细胞，卵母细胞急剧减少（见图1－14）。体腔液中卵母细胞团和游离卵母细胞的数量均逐渐减少。肾管中的生殖细胞已基本排放干净或残留少量，肾管迅速萎缩。

2.2.5 休止期 10月下旬～11月初和6月中旬～下旬，卵巢萎缩至100～200μm，生殖细胞团由单一的卵原细胞构成（见图1－15）。体腔液中几乎没有生殖细胞（见图1－9），肾管完全萎缩。

3 讨论

3.1 单环刺螠生殖腺的发生与卵巢的结构

生殖腺是由生殖细胞和体细胞共同组成的。一般来讲，生殖细胞源于原始生殖细胞PGCs，后者多数情况下又往往在非生殖腺发生的地方产生，然后经过迁移抵达生殖嵴，与生殖嵴的体细胞共同构成原始的生殖腺；伴随着个体的生长发育，在性染色体、性激素或者环境因子的影响下，原始性腺分化为精巢或卵巢，并最终成熟［3］。由于不同动物的体制和进化地位不同，其PGCs和生殖嵴发生的位置和时间也存在一定程度的差异［4］。本实验中作者最早在3.5 cm幼螠尾部后肠的外壁处观察到生殖腺原基，它是由少量PGCs和后肠外壁局部的结缔组织构成。至4 cm幼螠时，性腺的基本结构已经具备。尽管随着发育，性腺的体积将有一定的增大，但比较而言单环刺螠的生殖腺极小，成熟期的性腺也仅有900μm，肉眼难于分辨。推测这也是多年来人们研究螠虫动物性腺发生没有成功的原因之一。本研究首次给出了螠虫动物生殖腺发生的实验证据。

从进化上来看，动物的生殖腺经历了由无定型（无固定形态和发生位置）到定型（固定的形态和发生位置）的演化。之前通过分离观察螠虫动物体腔液中的生殖细胞，认为螠虫动物生殖细胞的大部分发生过程都游离于体腔内进行，繁殖期时体腔膜可临时用来产生生殖干细胞（卵原细胞或精原细胞），在体腔液中发育成熟后转入肾管，排出体外［5］。本实验首次显示了单环刺螠卵巢为长期存在的一个固定性的结构，其由虫体后肠壁外的局部结缔组织和生殖细胞共同构成，为膜带状；生殖细胞成团或单个状分布于其中；性腺两端通过肌束固定在后肠的外壁和附近的体壁上，其结构相对于高等无脊椎动物的定型生殖腺而言要简单得多。单环刺螠生殖腺既没有明显而发达的结缔组织外膜，也没有排出管；卵巢中分布有不同发育时期的生殖母细胞（卵原细胞、不同发育时期的卵母细胞），它们以卵原细胞团或者单个较大的卵母细胞的形式由卵巢的结缔组织膜中脱离，并落入体腔中进一步发育，成熟的卵母细胞将进入肾管并排出体外，等待受精。因此单环刺螠卵子成熟前经历了2个发育场所（卵巢和体腔），这种方式与其近亲环节动物［6］和星虫动物［7］有很大的相似性，均属于由低等性腺类型向高等类型进化的过渡类型。

螠虫动物是从环节动物中分出的一个小门，由此二者在特征上既有相似又有差异，最典型的是二者在发育过程中都有体节产生，但是前者在体节幼虫之后，体节消失，因此体节仅在其个体发育较短的时期内存在；而环节动物则终生保持分化特征。这种分化差异或许也是导致它们的生殖腺分布、结构以及生殖细胞在其中发育持续时间存在差异的原因之一。Clank和Oliue调查了14个科的多毛类动物卵巢的分布情况并将其分为2种类型：一种是性腺分布于身体前端的少量体节中，另一种是在大量体节中重复分布［8］。2种类型的共性是性腺按照体节重复分布。单环刺螠明显的性腺结构发生于幼螠，此时虫体的体节已消失，因此其性腺未表现出环节动物样的分节分布特征，而是在体后部后肠附近极小的范围内发生，这种性腺不按体节分布的特征与同样由环节动物分出的另一个小门动物—星虫动物是一致的。星虫动物的卵巢也没有按节律分布，其位于身体前端腹侧收吻肌的基部，为指状小叶组成的带状结构［7］。3类动物中，星虫的生殖腺由于外由腹膜包被，内部各期生殖细胞（性原细胞，初级性母细胞，次级性母细胞）均有分布，可谓是较高等的类型［9］；单环刺螠次之，其卵巢中存在卵原细胞和早期初级卵母细胞，但无发达的结缔组织膜包被；最低等的应该是环节动物多齿围沙蚕，它没有固定的生殖腺，生殖腺由局部体隔膜上皮分化而来，卵巢内只存在卵原细胞［6］。

由上可见，3类动物生殖腺既存在相似性，说明它们存在亲缘关系；又存在差异。且性腺的差异性一定程度上与其物种进化关系是一致的。

3.2 单环刺螠卵巢的年发育周期

一般来讲，动物由幼体到成体的时期，同时也是性腺发育和成熟的时期。第一次性腺成熟对不少种类的动物来说是一生中的唯一经历，但对大量的海洋无脊椎动物来说，在一生中都有着多次性腺成熟的现象。在这种情况下，性腺在前一次发育成熟并排出精卵后即进入休止时期，待新的内外条件具备时再进入下一次发育过程。正是这种形态和生理变化的周而复始形成了性腺发育的周期性。

利用组织学方法，根据单环刺螠不同时期卵巢的大小、结构组成及体腔液中生殖细胞的发育状况，作者将单环刺螠卵巢年周期发育分为5个时期：增殖期（6月末～7月和11月～次年1月）、生长期（7月末～8月下旬和2月～4月初）、成熟期（8月末～9月中旬和4月～5月初）、排放期（9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬）和休止期（10月下旬～11月初和6月中旬～下旬）。与单环刺螠的生殖期（春季：4月下旬～5月下旬；秋季：9月中旬～10月中旬）相比，卵巢的成熟期与生殖期并不完全同步，性腺成熟期比繁殖期稍早。本实验性腺的年发育周期和生殖周期的研究结果将为深入进行单环刺螠生殖生物学研究以及该物种苗种繁育及增养殖开发具有促进作用。

［1］ 李凤鲁，王玮，周红.我国黄渤海螠虫动物（螠虫动物门）的研究［J］.青岛海洋大学学报，1994，24（2）：203－210.

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［3］ 张红卫.发育生物学［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［4］ Saffman E E，Lasko P.Germline development in vertebrates and invertebtates［J］.CMLS Cell Mol Life Sci，1999，55：1141－1163.

［5］ 李诺，宋淑莲，唐永政.山东沿海单环刺螠繁殖生物学的研究［J］.动物学报，1997，43（4）：433－435.

［6］ 杜荣斌，刘红梅，郑家声，等.人工养殖条件下多齿围沙蚕亲体培育和繁殖生物学的初步研究［J］.海洋科学，2009，33（11）：37－43.

［7］ 顾晓英，竺俊全，许式见，等.可口革囊星虫（Phascolosoma esculenta）卵子发生的组织学研究［J］.海洋与湖沼，2009，40（3）：283－288.

［8］ 多齿围沙蚕（Perinereis Nuntia Savigny）人工养殖条件下亲体培育生态条件和繁殖生物学的研究［D］.青岛：中国海洋大学，2004.

［9］ 竺俊全，王武，许世见，等.可口革囊星虫的精子发生及精子结构［J］.动物学报，2007，53（4）：733－741.