姚运红 邓 岩 胡新荣 高洪彬 唐泽立

鼻咽癌的发生发展涉及众多基因的甲基化[1]。Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)基因是新近发现的潜在肿瘤抑制基因[2,3]。在多种肿瘤组织中RASSF1A基因由于基因的突变、缺失或由于启动子区高甲基化而引起低表达或不表达[2～7]。在鼻咽癌中，RASSF1A是常见的甲基化基因之一，但文献报道的RASSF1A甲基化情况不一致[2～5,8,9]，目前针对鼻咽细胞系CNE-2Z的RASSF1A基因甲基化及去甲基化的研究也不多见。本文应用去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z，观察RASSF1A基因的去甲基化特点及重新表达的情况及CAN-2Z细胞的生长和克隆形成能力的改变，旨在探讨该基因在鼻咽癌发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

CNE-2Z(人低分化鼻咽癌细胞系)，广东医学院病理教研室建株并保存。PCR扩增仪(9600型，PE公司，USA)，EZ-DNA甲基化试剂盒Gold(D5005，Zymo公司)，5-Aza-CdR(5 mg/支，A3656，sigma公司)，DNA提取试剂盒(北京中杉公司)，PCR Master-mix (KT205-01,Invitrogen公司)，免疫细胞化学试剂[鼠抗人RASSF1A单克隆抗体(50 μl,ARF0551,ATGEN公司)、SP-9000通用型试剂盒、PBS缓冲液(2000 ml/包)、抗体稀释液(ZLI-9028)、DAB显色试剂盒等均购自北京中杉公司]。RASSF1A基因甲基化特异引物对(M)和非甲基化引物对(U)，含两组4对，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。一组序列[6],M1(93 bp):5′-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3′和5′-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3′,U1(105 bp)：5′-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3′和5′-CAAACCCCACAA-ACTAAAAACAA-3′；二组序列[7]M2(169 bp)：5′-GCTAACAAACGCGAACCG-3′和5′-GGGTTTTGCGA-GAGCGCG-3′，U2(169 bp)：5′-CACTAACAAACACAAACC-3′和5′-GGTTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 CNE-2Z 细胞培养 CNE-2Z细胞系于RPMI-1640培养液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml，0.056%NaHCO3，调节pH值至7.4)，置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养，0.25%胰酶-EDTA消化传代。

1.2.2 5-Aza-CdR处理实验 5-Aza-CdR 5 mg，溶解于1 ml PBS缓冲液中，再调配成1×10-5M(高浓度)和5×10-6M(低浓度)溶液，低温-60℃～-80℃保存。常规消化细胞传代，培养24 h后加入5-Aza-CdR处理，24 h后更换含5-Aza-CdR的新鲜生长液，培养3天后换成不含5-Aza-CdR的生长液继续培养。……