刘文其，袁 堃，康 敏，范小玲，毛 艳

(广西医科大学 1.第一附属医院 放疗科，2.研究生学院 广西 南宁 530021)

放射治疗是胸部恶性肿瘤的主要治疗手段之一，随着放疗设备不断更新、放疗技术不断提高，周围的正常组织得到了较好的保护，但在胸部恶性肿瘤在放疗时肺组织仍会因受到照射不可避免地造成放射性肺损伤［1］。基础和临床研究也表明，放射性肺损伤不仅仅是单一靶细胞损伤的结果，而是一个有多种细胞参与，多种细胞因子调控的复杂过程。为此，建立放射性肺损伤的小鼠动物模型，进一步探索放射性肺损伤的发生机制十分必要。本实验通过不同剂量分割模式照射Wistar大鼠右肺来建立放射性肺损伤模型，动态观察不同剂量分割模式照射对大鼠放射性肺损伤的影响。

1 材料

大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)定量检测试剂盒和鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)定量检测试剂盒，购自美国R＆D公司。

X线模拟定位机、60Co-γ射线放射治疗机，德国西门子公司。

健康成年SPF级雄性Wistar大鼠90只，体重180～200 g，由广西医学科大学实验动物中心提供，合格证号:0006586。

2 方法

2.1 分组

用5%苦味酸溶液涂染动物背部被毛，并采用随机数字表法将大鼠90只随机分为小分次照射组、大分次照射组和对照组，每组30只。

2.2 动物的麻醉、固定及照射

常规消毒皮肤后，采用10%水合氯醛溶液400 mg/kg进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠保持仰卧位、四肢伸直外展，用棉线将四肢固定于木板上，然后模拟机下定位，铅块遮挡左肺及纵隔，然后照射组大鼠均采用60Co-γ射线照射右肺，SSD=100 cm，右肺照射野2 cm×3 cm。小分次照射组2 Gy/次，每周照射5次，共15次;大分次照射组10 Gy/次，每周照射1次，共3次;照射总量均为30 Gy。对照组大鼠只麻醉不进行照射。

2.3 取材及检测

3 组大鼠分别于照射后 1，3，5，10，24 周末，各组每次随机抽取6只，称重记录后，用10%水合氯醛溶液400 mg/kg腹腔麻醉，从大鼠下腔静脉抽取血液5 mL，静置30 min，4℃，3 000 r/min离心10 min，取血清，在-80℃冻存。

抽完血后迅速切开胸腔，分离主支气管、食管及心脏大血管等，将双肺组织取出，将右肺组织置于提前准备好的浸有生理盐水的纱布上，然后切取右肺中叶组织3块浸于10%福尔马林溶液中固定24 h，按常规方法制作石蜡切片行HE常规染色，比较观察各组肺组织病理学变化。

采用酶联免疫吸附法(ELISA法)，按试剂盒说明书进行操作，检测血清TGF-β1、TNF-α含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大体标本观察

大分次照射组照射后第1周肺叶肿胀，少量新鲜出血点，质软，弹性较好;第3周肺组织充血水肿，表面见点片状出血灶;第5周肺表面呈暗红色，见少量的白色点状改变;第10周肺叶肿胀已经消失，表面有微小凹陷，质脆，可见明显散在瘀斑;第24周后肺叶体积缩小，呈灰黄色或灰白色，表面凹凸不平，质硬，弹性差。

小分次照射组照射后第5周肺表面可见少量的白色点状改变，其余时间大鼠肺组织表面光滑、饱满，质稍软，弹性较好，呈粉红色。

对照组肺叶外观无异常，表面光滑、饱满，质软，弹性好，呈粉红色。

3.2 病理形态学改变(光镜观察)

大分次照射组照射后第1周，肺组织毛细血管充血、水肿，少许炎症细胞浸润(图1A1);照射后第3周，为急性炎症表现，肺间质及肺毛细血管充血、出血，肺泡间隔增厚，肺间质水肿伴有少量红细胞渗出，可见较多的炎细胞浸润(图1A2);照射后第5周，急性炎症加重，肺间质及肺毛细血管扩张充血、出血，部分肺泡腔积液并有大量红细胞聚积，大量炎症细胞浸润，部分肺泡壁断裂，肺泡结构塌陷紊乱、融合(图1A3);照射后第10周，以增生为主，表现为间质细胞数增生较前显著，小静脉扩张，小动脉管壁增厚纤维化，肺泡腔泡沫细胞浸润，近肺被膜区域肺泡组织出现萎缩、塌陷，并有轻微肺泡间质纤维化表现(图1A4)。照射后第24周，表现为肺间质主要被纤维和胶原组织代替，肺泡腔狭窄甚至消失，外周可见少量巨噬细胞以及中性粒细胞浸润，管壁增厚纤维化，肺泡腔泡沫细胞浸润(图1A5)。

小分次照射组仅在照射后第5周时，可见在照射区内出现轻微水肿增厚，炎症细胞浸润，并没有出现明显的水肿、充血灶;照射后第24周时，局部视野下可见少量纤维沉着，纤维化程度非常轻微，但与对照组比较差异不大(图2)。

综上，大分次照射组大鼠肺组织病理变化呈进行性发展过程，经历炎症期、增生期和纤维化期，损伤的程度明显较小分次照射组严重;而小分次照射组照射后早期仅出现较轻微充血、水肿、炎症细胞浸润，后期仅有少量纤维沉着，肺组织损伤非常轻微，接近正常大鼠肺组织。

图1 大分次照射组各期肺组织病理病理变化(HE×400)

图2 小分次照射组各期肺组织病理病理变化(HE×400)

3.3 大鼠血清中TGF-β1的变化

结果见表1和图3。大分次照射组血清中TGF-β1含量从第1周开始呈线性增长，至第5周后其增长幅度减小，第5周到第24周，血清中TGF-β1含量基本维持在一较高水平。小分次照射组血清中TGF-β1变化幅度较小，从第1周开始，血清中TGF-β1含量缓慢上升，到第5周时达到峰值，而后又缓慢下降，到第24周时已基本回落至正常水平。

表1 3组血清TGF-β1含量比较(±s，n=6)

表1 3组血清TGF-β1含量比较(±s，n=6)

与对照组比较:1P＜0.05;与小分次照射组比较:2P＜0.05

组 别 TGF-β1(ng/L)1周 3周 5周 10周 24周对照组 7.01±1.74 8.49±1.68 8.37±1.46 8.62±1.24 8.15±1.24大分次照射组 9.16±1.14 10.58±2.522 10.72±1.752 9.73±1.592 8.79±1.162小分次照射组 10.35±1.45 15.40±1.661 20.91±1.911 21.36±1.471 20.88±1.331

比较各组血清TGF-β1的含量发现，大分次照射组血清中TGF-β1含量在每个时间点均高于对照组和小分次照射组;但在第1周时差异无统计学意义(P＞0.05)，自第3周起至第24周，含量均明显高于对照组和小分次照射组(P＜0.05);而小分次照射组血清中TGF-β1含量与对照组比较，自第1周起至第24周两组间无显著差异(P＞0.05)。

图3 3组血清TGF-β1含量变化曲线

3.4 大鼠血清中TNF-α的变化

结果见表2和图4。大分次照射组血清中TNF-α含量的变化呈抛物线，即从放疗后第1周开始，含量迅速升高，到第5周时达到峰值，此后迅速下降，到第24周时已接近正常水平。小分次照射组血清中TNF-α含量亦呈抛物线变化，即从放疗后第1周开始，含量由低位水平迅速上升，到第5周时达到峰值，而后迅速下降到第24周时已接近正常水平。

表2 3组血清TNF-α 含量比较(±s，n=6)

表2 3组血清TNF-α 含量比较(±s，n=6)

与对照组比较:1P＜0.05;与小分次照射组比较:2P＜0.05

组 别 TNF-α(ng/L)1周 3周 5周 10周 24周对照组 71.10±8.52 67.76±4.43 68.98±3.78 70.35±5.70 68.02±6.22大分次照射组 73.20±7.63 95.06±9.061 99.83±4.031，294.46±4.031 70.38±7.66小分次照射组 80.66±6.70 102.48±7.011113.57±6.341105.67±7.79174.00±6.94

图4 3组血清TNF-α含量变化曲线

比较不同剂量分割模式照射组血清TNF-α含量变化可见，大分次照射组血清中TNF-α含量在每个时间点均高于对照组和小分次照射组。在放疗第1周时，大分次照射组血清中TNF-α含量与对照组相近(P＞0.05)，自第3周起至第10周，则明显高于对照组(P＜0.05)。大分次照射组血清TNF-α含量与小分次照射组比较，仅第5周时明显高于小分次照射组(P＜0.05);在第1和24周时，两者无显著差异(P＞0.05)。自第3周起至第10周时，小分次照射组血清中TNF-α含量明显高于对照组(P＜0.05)。

4 讨论

TGF-β是一种多功能的细胞因子，肺脏是富含TGF-β的器官之一。TGF-β由血小板、巨噬细胞、内皮细胞等产生，它能促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，在组织器官的纤维化中发挥了十分重要的作用，被公认为纤维化形成与发展的启动枢纽，是关键性细胞因子。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三种亚型，而人体内以TGF-β1为主。TGF-β1主要作用为:①趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化;②刺激成纤维细胞合成胶原蛋白，以增加肺间质的胶原成分。同时可抑制胶原蛋白酶及纤溶酶原激活物的合成，减少肺间质细胞外基质(ECM)的降解;③趋化炎性细胞及单核巨细胞，合成释放 PDGF、TNF、IL-1、IL-6 等细胞因子，扩大生物效应［2］。肺受照射后 TGF-β1既能促进成纤维细胞增殖又加速纤维细胞系统终末分化，导致间充质细胞和成纤维化细胞之间比例失衡，成纤维细胞积聚导致肺间质纤维化形成。因此，TGF-β1被认为在放射性肺损伤中起到了至关重要的作用［3-5］。

本研究中，两照射组的大鼠照射后第1周血清TGF-β1含量都接近正常，此时肺组织的放射性损伤也处于早期的炎症期，损伤比较轻微。随后血清中TGF-β1含量迅速增长，而肺的急性放射性炎症改变也逐渐加重，到第5周血清中TGF-β1含量达到高峰时肺的急性炎症病理改变同时到达最严重，尤以大分次照射组明显。从本实验看出大鼠肺照射后血清TGF-β1含量与肺组织的炎症程度呈正相关，随着TGF-β1的逐渐升高，肺组织的病理损伤也逐渐加重。而随着放射性肺损伤发展的进程，在第10周以后肺组织开始了逐渐纤维化的过程，血清中TGF-β1含量一直维持在一较高水平(第5～24周)，结果表明血清中TGF-β1对放射性肺损伤引起的后期纤维化起到非常重要的作用。因此TGF-β1不仅对早期放射性损伤引起的急性炎症起到积极作用，而且对后期肺组织纤维化的形成发挥了重要作用。

TNF-α是细胞因子调节网络的启动因子，在正常组织炎症和纤维化的发生发挥重要作用。在TNF-α的作用下，血管内皮细胞的反应性改变、前列腺素的合成增加、凝血酶原调节蛋白受抑，引起微血管内凝血，同时TNF-α发挥趋化作用，诱导中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞的渗出，启动炎性反应。此外还诱发 IL-1、IL-6、MCP等细胞因子的合成释放，产生细胞因子的瀑布效应，因此TNF-α被认为在放射性肺炎的发病机制起着关键作用。Rube等［6］的研究表明，C57BL小鼠接受12Gy照射后，其肺组织中TNF-α等炎性因子存在一个双向升高的表达峰，第1个峰值出现在照射后数小时内(1～6 h)，这表明细胞因子的表达比先前认为的要早的多;而第2个峰出现在照射后8周左右，这正好同组织病理学上的急性放射性肺炎出现的时间相吻合。Zhang等［7］通过抑制TNF-α的释放来干扰放射性肺损伤的发生，发现射线诱导TNF-α的释放与早期的细胞死亡和潜在的肺损伤有关系。

本研究中，大鼠血清中TNF-α含量在照射后第1周处于一个较低水平，与对照组接近，此时肺组织的放射性损伤也处于早期的炎症期，损伤比较轻微。随后肺的急性放射性炎症改变也逐渐加重，这时血清中TNF-α含量由低位水平迅速升高。随着放射性肺损伤的发展，在第10周以后肺组织的逐渐纤维化的过程中血清中TNF-α含量却回落至正常水平(第10～24周)，结果提示血清中TNF-α对后期放射性肺损伤引起的肺纤维化没有发挥作用。由此可见，大鼠肺照射后血清中TNF-α仅与急性炎症的严重程度密切相关。

本研究采用不同剂量分割模式照射下，大分次照射组和小分次照射组血清中TGF-β1含量都是从放疗结束后第1周开始上升，但小分次照射组却在第5周达到峰值，而大分次照射组血清中TGF-β1含量在第10周达到高峰。在这段时间内，两组大鼠肺组织的病理改变均表现为急性炎症反应，但小分次照射组严重程度较大分次照射组轻。与此同时，小分次照射组血清中TGF-β1含量也明显低于大分次照射组，且在第3～10周时两组血清中TGF-β1含量的有显著差异(P＜0.05);第24周时，大分次照射组大鼠肺组织出现了严重的不可逆的纤维化，而小分次照射组仅出现极轻微的纤维化。表明在接受相同总剂量照射时，大分次照射组无论是早期的放射性肺炎还好晚期的纤维化都明显比小分次照射组严重。

本研究中，大分次照射组血清中TNF-α含量高于小分次照射组，在第5周时有显著差异(P＜0.05);肺组织的急性炎症大分次照射组亦较小分次照射组严重。到第24周时，两组TNF-α含量已接近，并回落至正常水平，但大分次照射组大鼠肺组织出现明显的纤维化，而小分次照射组肺组织损伤的非常轻微，接近正常大鼠肺组织。由此可见，在接受相同总剂量照射时，小分次照射组血清中TNF-α含量升高幅度低于大分次照射组，早期的放射性肺炎也明显较大分次照射组轻。而对于后期纤维化则与TNF-α关系不大。

本研究结果显示，照射总剂量相同而采用不同剂量分割模式照射，小分次照射组无论是早期的放射性肺炎还是晚期的纤维化都明显较大分次剂量照射组轻，在后期几乎没有发生明显的肺组织纤维化。可见在接受相同剂量照射条件下，小分次照射模式进行照射更有利于肺组织等晚反应组织的保护。动物实验资料显示，肺的分割照射α/β值为2.5～4.5 Gy，人类临床资料推导人肺的α/β值为1.5～3.5 Gy，因而肺属于晚反应组织。晚反应组织受到照射后主要通过亚致死性损伤的修复来抵御放射损伤，因此小分次照射对晚反应组织有良好的保护作用。

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