翟凤馨，郑石磊

(辽宁医学院 附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

近年来，随着人们对热疗治疗肿瘤机理研究的不断深入，热作用对肿瘤细胞结构、功能和生长代谢的影响得到肯定。临床上一般认为，肿瘤局部组织加热到43℃并持续一定时间即可获得满意疗效［1-2］。热作用可使肿瘤细胞坏死，并诱发其凋亡［3］，同时可提高机体免疫力，对防止肿瘤转移起到积极作用［4］。经导管肝动脉化疗栓塞术(Trancatheter arterial chemoembolization，TACE)是非手术治疗肝癌的首选方法，TACE联合其他药物和疗法治疗肝癌已有一定的研究[5-6]，然而，TACE结合热疗治疗相关研究较少。本实验通过热疗联合TACE治疗兔VX2肝种植瘤模型，探讨其对VX2肿瘤生长、血管生成的影响。

1 材料

超液态碘化油，法国Guerbet公司;盐酸阿霉素，浙江海正药业;碘普罗胺，德国拜耳公司;CD34、血管内皮生长因子(VEGF)抗体和即用型SABC免疫组化染色试剂盒，北京博奥森公司;VX2瘤株由本院放射线科雷震教授惠赠。

Siemens Definition AS+128层 CT机;Siemens AX10-M Artis dTA DSA;SR-1000深部射频热疗机(深圳先科医疗公司);CIAS-1000型细胞图像分析系统(北京恒大公司)。

日本大耳白兔，雌雄不限，体重2.6～3.1 kg，平均2.9 kg，由辽宁医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(辽)2009-0004。

2 方法

2.1 动物模型制备及分组

将VX2组织块剪碎制成悬液，注射于传代兔后腿内侧肌肉，14 d后可触及包块，剥离生长活跃的瘤组织剪成约2 mm3/块，各实验兔麻醉后，开腹直视下暴露肝左叶，以5F导管鞘刺破肝包膜约5 mm，用其内芯推入瘤块3个，以明胶海绵封堵穿刺通道，缝合上腹切口。VX2荷瘤兔40只随机分为对照组(A组)、碘油组(B组)、热疗组(C组)、阿霉素加碘油组(D组)、热疗联合阿霉素加碘油组(E组)，每组8只。

2.2 治疗

肿瘤植入后14 d进行治疗，3F-SP微导管经兔股动脉插至腹腔动脉，手推60%碘普罗胺5 mL行腹腔动脉造影，超选择至肝左动脉并进行相应治疗。A组:经导管缓慢注入生理盐水10 mL;B组:超液态碘化油0.3 mL/kg经导管缓慢注入，术中严密观察碘油沉积情况;C组:单纯热疗，热疗机频率40.7 MHz，电容式加热，极板直径15和20 cm，治疗功率800～1 000 W，调节匹配控制在3%以下，测温系统由高阻线测温传感器和计算机组成，精确度为±0.1℃，治疗时间30 min;D组:超液态碘化油0.3 mL/kg与阿霉素2 mg/kg采用“泵法”反复混合后制成乳剂，经导管缓慢注入;E组:超液态碘化油0.3 mL/kg与阿霉素混合乳剂2 mg/Kg栓塞后按C组方法行热疗，治疗时间亦为30 min。

2.3 观察指标

2.3.1 肿瘤体积及生长率 肿瘤植入后14及21 d参照何东风等［7］报道的方法行CT扫描。计算肿瘤体积及生长率。肿瘤的体积(V)=(1/2)ab2，其中a为最大径，b为最小径;肿瘤生长率=(V治疗后/V治疗前-1)×100%。

2.3.2 血清ALT、AST水平 肿瘤植入前、植入后14 d及治疗后7 d耳缘静脉取血3 mL，分离血清并于-20℃保存，采用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平。

2.3.3 微血管密度(MVD)、VEGF免疫组化检测

MVD计数采用Weidner报告的方法［8］，低倍镜下选择血管热点区后在高倍镜下计数3个视野的棕染血管数，取均值作为MVD值;VEGF表达参照吴文娟等［9］报道的方法采用吸光度值表示，每张切片选取5个视野计算得出平均吸光度值。

2.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS16.0软件进行处理。计量资料采用(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析;MVD计数与VEGF表达采用双变量相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组实验兔体重、肿瘤体积及生长率

结果见表1。治疗前各组兔体重无显著差异;治疗后各组兔体重均略有下降，但与治疗前比较均无显著差异，各组间比较差异也无统计学意义。与A组比较，各组治疗后肿瘤体积及生长率均受到不同程度抑制，E组肿瘤体积及生长率最小，与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组兔的体质量、肿瘤体积及生长率测定结果(n=8，±s)

表1 各组兔的体质量、肿瘤体积及生长率测定结果(n=8，±s)

与A组比较:1P＜0.05;与B、C、D组比较:2P＜0.05

组 别 体重/(kg)治疗前 治疗后肿瘤体积/(cm3)治疗前 治疗后 生长率/%A组 2.89±0.21 2.82±0.22 1.25±0.25 3.64±0.55 339.3±76.6 B组 2.83±0.22 2.71±0.19 1.27±0.27 2.53±0.411 218.4±43.91 C组 2.90±0.24 2.81±0.20 1.30±0.29 2.32±0.401 195.5±40.61 D组 2.83±0.23 2.67±0.22 1.32±0.32 2.26±0.341 189.8±36.91 E 组 2.86 ±0.20 2.76±0.19 1.28 ±0.28 1.59±0.321，2 118.7±21.31，2

3.2 血清AST、ALT水平

结果见表2。第1天(种植前)各组兔ALT、AST差别无统计学意义。第14天ALT及AST均升高，各组间比较差异无统计学意义。第21天，各栓塞治疗组(B、D、E组)ALT、AST升高幅度明显大于 A、C组;B、D、E三组间ALT、AST比较差异无统计学意义;三个时间点各组兔ALT、AST呈升高趋势，组内比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组兔血清ALT、AST测定结果(n=8，±s)

表2 各组兔血清ALT、AST测定结果(n=8，±s)

与1 d比较:1P＜0.05;与14 d比较:2P＜0.05;与A组比较:3P＜0.05

组 别 ALT(u/L)1 d 14 d 21 d AST(u/L)1 d 14 d 21 d A 组 39.7±4.3 76.7±14.21 96.7±14.81，2 26.7±4.5 76.5±14.01 113.5±13.51，2 B 组 37.3 ± 3.9 74.5 ± 12.21 261.4 ± 26.31，2，3 27.4 ± 4.7 75.5 ± 15.91 305.5 ± 24.71，2，3 C 组 38.7 ± 4.0 73.7 ± 11.61 189.3 ± 20.41，2，3 28.4 ± 4.9 74.4 ± 17.51 196.6 ± 18.71，2，3 D 组 36.7 ± 2.4 77.7 ± 15.21 281.6 ± 26.31，2，3 25.7 ± 4.1 74.4 ± 16.51 318.5 ± 30.61，2，3 E 组 37.3 ±4.1 78.5 ±16.21 265.7 ±24.41，2，3 26.4 ±4.4 73.5 ±13.31 312.7 ±32.31，2，3

3.3 残存肿瘤区MVD、VEGF表达

结果见图1～2和表3。肿瘤组织中血管内皮细胞膜CD34阳性表达为棕黄染色，表达的肿瘤微血管分布不均，其中E组MVD计数最少，与其他各组比较差异有统计学意义;VEGF呈弥漫性或集中表达于几个瘤巢中，VEGF阳性表达为胞浆、胞核棕黄染色，在靠近肿瘤边缘区域及癌巢中表达较强，B、D组VEGF表达强度最强，E组VEGF表达最弱，差异有统计学意义。MVD与VEGF表达强度之间呈正相关。

图1 阿霉素加碘油组(A)、热疗联合阿霉素加碘油组(B)CD34染色(×100)

图2 阿霉素加碘油组(A)、热疗联合阿霉素加碘油组(B)VEGF染色(×400)

4 讨论

热疗对肿瘤细胞具有较强的直接杀伤能力，而且还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并促进其凋亡，能使化疗药更有效地渗透进肿瘤细胞内，促进化疗药物与肿瘤细胞结合，与化疗药物具有一定的协同作用，而且在化疗药物用量固定的情况下提高其灭活肿瘤细胞的作用［10］。Liang等［11］报道热疗可以通过改变凋亡基因p53、Bcl-2和Bax的表达进而提高化疗的疗效，促进肿瘤凋亡。TACE是目前非手术治疗肝癌的首选方法，其增加了肿瘤区域的化疗药物浓度，不仅阻断肿瘤血供，而且使药物在肿瘤内的停留时间延长。本研究发现，热疗联合TACE治疗组荷瘤兔，其肿瘤体积及生长率均低于其他各组，热疗提高了肿瘤对化疗药物的敏感性，说明热疗与栓塞化疗产生了一定的协同作用，其作用机制可能与抑制多耐药基因的表达有关［12］，抑制肿瘤生长的效果优于单纯TACE组、热疗组及碘油组。

表3 治疗后1周各组实验兔肿瘤MVD及VEGF的表达(n=8，±s)

表3 治疗后1周各组实验兔肿瘤MVD及VEGF的表达(n=8，±s)

与A组比较:1P＜0.05;与B、C、D组比较:2P＜0.05

组 别 MVD VEGF表达强度 r值 P值A组22.5±3.8 0.147±0.020 0.889 0.003 B组 23.9±4.0 0.169±0.0241 0.824 0.013 C组 21.2±4.2 0.146±0.018 0.831 0.013 D组 25.4±4.8 0.166±0.0231 0.861 0.006 E 组 16.8 ± 3.61，2 0.122 ± 0.0171，20.812 0.016

通常，肝组织受损伤最常用的指标主要包括ALT和AST，二者的升高主要提示存在急性肝损伤。本实验中使用血清AST、ALT水平来评价各治疗组实验兔的肝功损害程度。结果表明，肿瘤植入后1，14及21 d各组实验兔AST、ALT呈逐渐升高趋势，治疗后与对照组相比，各治疗组均对肝功能有一定的损害，组间差异无统计学意义(P＞0.05)。这与高建华等［13］的研究结果相符，说明热疗不会加重TACE治疗对肝组织的损害。临床上肝癌患者常伴有较重的肝硬化病史，肝功能往往均受到一定影响，而热疗联合TACE治疗不会加重肝损害，因此，热疗联合TACE治疗是可行的。

在肿瘤浸润、生长和转移的过程中，血管生成越来越受到重视，其中MVD与VEGF是肿瘤血管生成的最主要因素，因此，VEGF也成为许多药物治疗的靶点。在热疗后，肿瘤细胞中的VEGF基因表达和蛋白质合成明显受到抑制，血清VEGF水平明显降低［14］。因而提示热疗可用于防止肿瘤生长和转移，其抑制肿瘤生长和转移的机制可能与抑制VEGF表达降低MVD有关。本研究各组兔治疗后7 d取材，免疫组化检测MVD和VEGF结果表明热疗联合TACE组的MVD和VEGF与其他三组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，表现为热疗联合TACE治疗组均值最低，TACE组均值略高于对照组，该结果与Sawaji等［14］的结论相符。另外，碘油具有受热后黏滞度下降等物理特性，在TACE术后肿瘤组织局部加温，使病灶部位沉积的碘油黏度下降，增强了其在肿瘤组织中的填充程度和对肿瘤交通支的栓塞，更有利于栓塞趋于完全，进一步促进肿瘤缺血、坏死。热疗联合TACE治疗后，残存肿瘤区MVD、VEGF表达均在一定程度上降低，说明该治疗产生了一定的抗血管生成作用。阿霉素碘油组治疗后残存肿瘤区MVD及VEGF表达甚至略高于生理盐水组，表明其对肿瘤血管生成无明显抑制作用，原因可能在于由于栓塞导致肿瘤内部缺氧，缺氧是诱导VEGF表达的最主要因素，同时低氧诱导因子-1等调节对血管生成起中心作用的VEGF基因转录，从而促进 VEGF表达，进而引起肝癌复发和转移［15］。

综上所述，热疗联合TACE治疗对于肿瘤的生长及血管生成具有较明显的抑制作用，且不会加重肝功能损害。但是热疗与TACE联合治疗肝癌的具体机制仍需进一步研究。随着对热疗与介入技术研究的不断深入，热疗与TACE联合治疗肝癌及其他肿瘤方面具有广阔前景。

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