钱建国，吴秋丽

(1.河北辛集市第二人民医院 河北 辛集 052360;2.天津医科大学，天津 300192)

骨肽注射液在临床常用于骨折和修复坏死骨治疗骨质疏松等，并取得良好效果［1］，但骨肽注射液对上述病症的治疗机理研究较少，本课题研究了骨肽注射液对新生大鼠的成骨细胞生长的影响，考察其疗效的可能机制。

1 材料

骨肽注射液(国药准字 H20003923，批号:100101规格:2 mL∶10 mg)，蚌埠市宏业生化制药厂;D-Hanks液，天津百浩生物科技有限公司;DMEM培养基，上海源聚生物科技有限公司;胰蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司;Ⅱ型胶原酶，美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)，上海川翔生物科技有限公司;碱性磷酸酶，上海科兴生化试剂有限公司;NBT-BCIP碱性磷酸酶检测试剂盒，昊柏生物科技有限公司。

DNM-9602酶联免疫检测仪，上海京工实业有限公司;BB5060细胞培养箱，德国Hereus公司。

健康新生SD大鼠，雄性，1 d龄，河北省实验动物中心中心提供，合格证号:SCXK(冀)2008-1-003。

2 方法

2.1 小鼠成骨细胞的体外培养及鉴定

取新生1 d健康SD大鼠5只，处死，于75%酒精浸泡10 min，置于消毒培养皿中，剪开头顶皮肤分离颅盖骨，将颅盖骨放入D-Hanks液中去除骨膜及周围结缔组织，D-Hanks液冲洗2次，剪成0.1 mm3的骨片块，浸入0.25%胰蛋白酶，37℃消化30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加Ⅱ型胶原酶10 mL，37 ℃振荡消化 2 h，1 000 r/min离心5 min，DMEM培养液冲洗3次，重复离心。加含10%FBS的DMEM培养液制成细胞悬液，调节细胞密度为1×105，接种于培养瓶，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h后换液，每2 d换液1次，原代细胞至铺满瓶底，0.25%胰酶消化，多次贴壁法纯化成骨细胞。培养至第3代待用。倒置显微镜下连续观察细胞形态，NBT-BCIP法定性检测碱性磷酸酶，鉴定成骨细胞［2-3］。……