宋 宇(综述)，段 勇，王玉明(审校)

(昆明医学院第一附属医院检验科，昆明650032)

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要作用。凋亡抑制会导致自身免疫性疾病或肿瘤，而凋亡亢进与组织器官退行性病变有关。凋亡是多基因严格控制的过程，涉及一系列凋亡信号转导系统，目前比较清楚的通路主要有外源性途径和内源性途径。Bcl-2家族分子在内源性(线粒体)途径中起重要作用，其中p53上调凋亡调控因子(puma)是Bcl-2家族BH3-only亚家族成员，可被p53快速诱导并具有强大的促凋亡作用。

1 puma的结构和功能

2001 年，Yu［1］和 Nakano 等［2］两个独立的研究小组分别从结直肠癌细胞系和人类成骨细胞样细胞中分离出新的可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用的p53靶基因，后被鉴定为同一基因，并命名为puma。人 puma 基因定位于 19q13.3～ q13.4，cDNA全长1.9 kb，富含GC序列。该基因具有4个外显子(1a或1b、2、3、4)和3 个内含子，其中外显子 2 含假定的转录起始位点，外显子3中含编码BH3的序列。转录后形成四种不同的剪接体(puma-α、-β、-γ 和-δ)。其中只有 puma-α(相对分子质量为 23×103)和puma-β(相对分子质量为18×103)编码的蛋白中含有促凋亡活性所必需的BH3功能结构域。puma编码产物为193个氨基酸的蛋白质，其中C端疏水序列和BH3结构域分别是puma定位和促凋亡功能的基础。puma直接或间接地与抗凋亡Bcl-2蛋白发生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL对Bax/Bak的抑制作用，Bax/Bak构象改变后在线粒体膜上形成寡聚物，使膜通透性增加、外膜电势降低、释放细胞色素C入胞质，启动caspase级联反应，最终发生细胞凋亡。

2 puma在细胞凋亡中的作用

迄今为止一共发现了8个BH3-only蛋白，它们在哺乳动物中广泛存在，有学者提出特异性应激刺激能协同个别BH3-only蛋白激活线粒体凋亡途径的假说，puma作为BH3-only家族成员也得到了广泛研究［3］。生理状况下puma表达量较低，但在DNA损伤药物、血清饥饿和内质网应激等刺激诱导下可显著升高。研究表明［3］，puma-/-细胞株对p53转录依赖的刺激(如γ射线)和p53转录非依赖的刺激(如细胞因子缺失、糖皮质激素和佛波酯等)发生凋亡抵抗现象。近年来，puma在促凋亡过程中的作用得到了广泛认可，研究puma在凋亡相关疾病和细胞株中的表达、在化学物质暴露下的表达改变成为了当前研究的热点。

2.1 puma在细胞株中的表达 Uo等［4］发现在原代培养的鼠神经细胞中，puma基因的表达与喜树碱诱导的神经细胞凋亡密切相关。Niizuma等［5］通过夹闭大鼠双侧颈总动脉构建短暂性脑缺血模型，发现海马CA1区线粒体样本的puma蛋白表达显著上调，免疫共沉淀显示puma与Bax结合，表明puma在短暂性脑缺血后海马CA1区迟发性神经元死亡中发挥着重要作用。Kuroki等［6］采用线栓法制备鼠短暂性脑缺血/再灌注动物模型，在不同的时间点取出脑组织进行mRNA定量分析和蛋白质印迹分析，结果显示栓塞侧皮质puma mRNA和PUMA蛋白明显高于对侧，该实验为局灶性脑缺血引起BH3-only基因puma的转录和翻译提供了体内实验依据。Ghosh等［7］分别对出生 7 d 的 puma-/-、Noxa-/-、Bim-/-、Hrk-/-和p53-/-幼鼠皮下注射乙醇以模拟宫内乙醇暴露的影响。结果显示，仅puma-/-幼鼠神经细胞明显抵抗凋亡，表明宫内乙醇暴露通过p53非依赖、Bax和puma依赖的途径诱导神经细胞凋亡。

人肝脏Huh-7细胞株在饱和脂肪酸刺激下发生脂性凋亡，puma mRNA和蛋白表达显著上调，RNAi干扰 puma后细胞凋亡被明显抑制［8］。McKenzie等［9］将 Bim-/-、Noxa-/-、puma-/-、Bid-/-的胰岛 β细胞分别暴露于高浓度葡萄糖，发现puma-/-明显抵抗线粒体途径凋亡，表明puma在葡萄糖毒性诱导的胰岛β细胞凋亡中起了关键作用。

Waster等［10］利用紫外灯管模拟紫外光源照射人黑素瘤细胞后发现，紫外辐射导致黑素瘤细胞凋亡，puma mRNA表达量随紫外光源照射暴露的时间呈时间依赖性。Karst等［11］研究了107例原发性黑素瘤、51例转移性黑素瘤和64例结构不良痣后发现，puma表达与恶性程度呈显著负相关，是5年疾病特异生存率的独立预测因子。

免疫细胞大量凋亡是导致脓毒症高病死率的重要因素之一。抑制免疫细胞的凋亡成为了控制脓毒症进展的靶点。Brahmamdam等［12］构建小鼠盲肠结扎穿孔脓毒症模型，发现败血症脾脏CD4+T细胞中puma表达与对照组差异有统计学意义。siRNA沉默puma基因后，CD4+T细胞中PUMA蛋白显著下降，同时免疫细胞存活率上升，表明puma在凋亡引起的CD4+T免疫细胞耗竭中起着重要作用。Inoue等［13］的研究也表明白细胞介素15通过增加抗凋亡Bcl-2、减少促凋亡基因Bim和PUMA蛋白表达来抑制免疫细胞凋亡。

Obexer等［14］利用 RNAi干扰 puma后发现，糖皮质激素诱导的p16INK4A重组白血病细胞的凋亡被显著抑制，表明puma表达在很大程度上介导抑癌基因p16INK4A诱导的凋亡敏感性。Iglesias-Serret等［15］发现puma在阿司匹林诱导的人白血病细胞株凋亡中发挥促凋亡作用。

Hoque等［16］对30例原发肿瘤标本和10株头颈部鳞癌细胞株的puma编码区序列进行检测，结果表明无论p53处于何种突变状态，所有标本中均未见puma突变。徐波等［17］发现，糖皮质激素在诱导体外培养的白血病细胞凋亡过程中，不能引起puma表达的上调。

2.2 puma在人体组织中的表达 陈鑫等［18］利用半定量反转录-聚合酶链反应检测胃癌组织、癌旁组织中四种剪接体的mRNA表达水平，发现puma四种剪接体在胃癌组织中的表达下调，与癌的发生呈负相关。Jansson等［19］应用免疫组化和半定量反转录聚合酶链反应技术研究散发的大肠癌，发现puma mRNA、蛋白在肿瘤组织中的表达与正常黏膜相比，既有上调也有下调，puma上调或下调与临床病理特征及预后均无相关性，因此得出puma表达的改变在大肠癌的发展中发挥次要的作用。王玉明等［20］研究表明，puma mRNA和蛋白在非小细胞肺癌、癌旁和远癌肺组织和肺良性病变组织中差异无统计学意义，puma表达可能不是伴随肺癌发生和侵袭发展过程的重要因素。puma在某些细胞株凋亡、肿瘤组织和自身免疫疾病等的发生、发展中发挥着重要作用，但在某些组织或细胞中可能发挥次要作用或不发挥作用。

3 化学药物对puma表达的影响

皮质神经细胞经河豚毒素处理3 d后，puma基因表达水平显著升高并最终导致细胞凋亡［21］。Zn2+使神经母细胞瘤细胞株中的puma表达呈剂量和时间依赖效应［22］。植物赫曲毒素A能上调人肝癌细胞puma表达［23］。组蛋白去乙酰酶抑制剂通过p53-puma-Bax途径诱导神经母细胞瘤细胞的凋亡［24］。抗肿瘤药物Zolinza/vorinostat能显著提高耐药乳腺癌细胞移植的裸鼠对肿瘤坏死相关凋亡诱导配体诱导的凋亡敏感性［25］。Hung 等［26］发现，puma 在一氧化氮诱导的神经前体细胞线粒体凋亡过程中发挥着关键作用。

4 其他转录途径调节和转录后调节puma

Lam 等［27］发现，MAP4K3 通过 mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶)转录后调节PUMA蛋白表达，进一步激活Bax，最终促进胰腺癌细胞株的凋亡。Sun等［28］发现，puma通过p73β和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号途径介导上皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂诱导的头颈部鳞状细胞癌细胞株凋亡，为了进一步验证puma在该途径中的作用，Sun等［28］应用短发夹RNA干扰puma后发现，鳞状细胞癌细胞株凋亡率显著降低。丝/苏氨酸蛋白激酶通过磷酸化降低TAp63蛋白的稳定性来抑制TAp63诱导的肝肿瘤细胞凋亡［29］，在p53变异的肝肿瘤细胞株中剔除丝/苏氨酸蛋白激酶能反式激活puma，并进一步诱导细胞凋亡。除此之外，细胞转录因子、缺氧诱导因子1α和FoxO3a也转录调节puma基因［30-32］。

5 问题与展望

自2001年几个实验室相继报道了puma基因强大的促凋亡作用之后，对puma的研究逐渐成为热点，不少研究已经证实了puma在介导多种肿瘤细胞株凋亡中的重要作用，但仍有许多问题亟待解决:①puma缺陷是否会有发生肿瘤的倾向。②体外实验表明诱导puma表达能促进肿瘤细胞凋亡，但在体内试验中的效果和安全性不能确定。③某些情况下p53和puma过表达细胞却不发生凋亡的原因尚待探究。④puma还受到哪些因素和途径调控，以及这些调控网络之间的联系也待阐明。目前研究puma在组织和细胞株中的促凋亡作用以及化学药物对puma的影响都是为今后的体内实验和肿瘤治疗作准备。相信随着研究的逐渐深入，对恶性肿瘤和凋亡相关疾病的治疗会有突破性进展。

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