汪艳丽(综述)，刘如秀(审校)

(中国中医科学院广安门医院心内科，北京100053)

心脏的最高起搏点为窦房结，窦房结细胞的自律性决定心率的快慢，窦房结细胞的自律性受到很多因素影响，其中最主要的是超极化激活环核苷酸门控阳离子通道及其产生的电流，现对近年来对窦房结细胞自律性与该通道及电流的关系研究进展予以综述。

1 窦房结细胞的自律性

心脏的自律性来源于特殊传导系统的自律细胞，其中窦房结细胞的自律性最高，称为起搏细胞，是正常的起搏点。窦房结细胞属慢反应电位的节律性活动细胞，其动作电位幅度小，静息电位也小，动作电位中没有平台，只有0、3、4期，4期不稳定，在复极完毕后，就自动、缓慢地除极，使膜电位逐渐减小，即4期自动除极。当除极达到阈电位水平(约－40 mV)时即可暴发动作电位，因此，4期自动除极是形成窦房结细胞自律性的基础。该除极化过程是通过细胞膜上各种离子流的参与实现的［1］。

经典的电生理理论认为参与窦房结细胞4期自动除极的离子流包括超极化激活环核苷酸门控阳离子电流(起搏电流，简称If)、延迟整流性钾电流(Ik)、内向钙电流(ICa)等，其中起主要作用的是起搏电流If［2］，是窦房结起搏细胞产生自律性的必需离子电流，它参与窦房结细胞早期自动化除极后1/3相，对窦房结细胞自律性的产生起着举足轻重的作用［3］。

2 If相关研究

If是一个被超极化所激活的、缓慢作用于舒张期电压超极化的内向电流，此电流具有与其他电流不相同的特性。20世纪70年代后期，Brown 等［4］首次提出了起搏电流参与引起动作电位中的舒张期除极，其主要成分是Na+和K+，尤其是Na+的 内 流。 DiFrancesco［5］认为，If是窦房结细胞的主要起搏离子流，他和实验室的同事用2～5 mmol铯加在游离的单个窦房结细胞上阻断If离子流可以减慢其自律活动，用只减慢心率不降低收缩力的合成心动过缓剂UL-FS49也有同样效果。迷走神经递质乙酰胆碱减慢心率的作用很可能是通过抑制If而实现，因为If对其十分敏感(乙酰胆碱抑制If的半最大效应浓度仅为0.09 μmol，而它对 ICa-L的抑制作用即使浓度高达 300 μmol也仅能降低 30% 幅值)［6］。

Barbuti等［7］通过膜片钳技术、免疫荧光技术以及PT-PCR技术描述了小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)分化的心脏起搏细胞的If电流的分子组成和功能特性。研究发现If通道的阻断剂伊伐布雷定(3 μmol)能够阻断50%的If电流，并使收缩频率下降25%。通过免疫荧光方法表明，分化的起搏细胞表达超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyper-polarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN)1 和 HCN4。

有研究表明缺血导致If的抑制。张倩等［8］的研究显示，模拟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)使乳鼠窦房结细胞If激活曲线右移，并显著增加各指令电压下的If密度;缺血预适应(ischemia preconditioning，IP)可抑制 I/R增强 If作用，有助于维护I/R时窦房结细胞电生理活动的相对稳定性。在对乳鼠窦房结细胞缺氧预适应(hypoxic preconditioning，HP)的研究中，缺氧/复氧使窦房结细胞If激活曲线右移，并显著增加各指令电压下的If密度;而HP和Diazoxide预处理均能明显减轻缺氧/复氧对If的影响，使If回复到接近正常对照水平。缺氧/复氧导致的窦房结细胞内Ca2+超载可能是引起If幅值增大，激活曲线右移的重要原因，而HP及Diazoxide对If的作用也很可能与减轻缺氧/复氧引起的Ca2+超载有关。

3 窦房结细胞If相关离子通道

3.1 通道结构与分型 编码产生If电流的HCN家族有4种亚型:HCN1～4。每一种亚型都含有6个跨膜区域和1个环核苷酸结合区域(cyclic nucleotidebinding domain，CNBD)。HCN通道在结构上类似电压依赖性的钾通道，为4个亚基形成的四聚体，每个亚基包括6个跨膜螺旋片段(S1～6)，其中S4片段带正电荷起电压传感器作用，介于S5与S6之间有一个离子传导孔区域即P区，对钾和钠离子有通透性，在C端有环核苷酸结合区CNBD，能与环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)结合而调节HCN通道的电压依赖性。该区与其他几种环核苷酸结合蛋白(如cAMP激活的蛋白激酶、CNG通道)序列高度相似。HCN通道家族在从S1区到CNBD之间的核心区域都是高度保守的(有80%～90%的序列相同)，两端区域的变异性较大，具有较低的同源性［9］。

HCN的4中基因亚型在哺乳动物中被成功克隆，在哺乳动物的心脏组织中四种基因亚型均被发现，在心脏中HCN1、HCN2和HCN4是主要的亚型，负责形成If［10］，主要的HCN 转录产物是HCN4。人和其他动物窦房结表达很高水平的 HCN，HCN mRNA［11］在兔窦房结是浦肯野细胞的40倍，是心室肌工作细胞的140倍。兔窦房结HCN4可占HCN mRNA表达的4/5，HCN4剔除大鼠在出生前就死亡，但胚胎显示有严重的心动过缓，心脏If下降85%［12］。对动物心脏胚胎发育的研究表明，在胚胎心脏发育的早期，心室肌细胞仍维持较高的自律性，随着发育的成熟，心室肌细胞HCN基因的表达水平逐渐下降，其中HCN4的下降更为明显，最终使心室肌细胞丧失自律性。基因剔除的研究也表明，HCN4基因全部缺失的小鼠由于不能形成“成熟”的起搏动作电位而不能存活，而部分缺失的小鼠心脏窦房结的自发搏动频率显著下降超过50%［13］。这说明HCN4基因不仅在窦房结起搏细胞的自发电活动中起着主要的作用，而且对心脏传导系统的功能发育也起着非常重要的作用。

窦房结细胞HCN4表达的异常与窦房结功能紊乱密切相关［14］，某些心律失常的发生可能与窦房结急性I/R损伤后，窦房结细胞HCN4表达减低，其主导的起搏电流 If异常有关［1］，付勇等［15］研究 I/R 损伤对在体兔窦房结细胞影响中发现，窦房结急性I/R损伤对窦房结细胞HCN4表达量改变有影响，缺血时间越长，再灌注损伤越重。通过上调起搏电流If，可提高窦房结细胞自律性，以缓解缓慢性心律失常［16］。

3.2 通道特性 HCN 通道具有以下特性［9，17-21］:①由超极化电位激活。If激活阈值－40～－50 mV，正好是窦房结细胞舒张除极期间，最大激活电位在－100 mV、完全激活的电流/电压关系曲线显示反转电位在－10～－20 mV之间。②对K+和Na+的通透性。If电流是在正常生理条件下含有钠和钾离子的混合性正离子流，其相对通透比率为0.24～0.31。最近有研究发现，HCN通道对钙离子有通透性。在静息电位水平通道激活的结果是形成一个主要由Na+携带的净内向电流，它可使膜发生除极而接近AP启动的阈电位。③可以被Cs+以电压依赖性方式阻断。2 mmol/L的Cs+可以几乎完全可以阻滞该电流。④可被细胞内侧的cAMP上调。cAMP与通道蛋白耦联，促进通道激活的动力学过程并改变其对正性电压的电压依赖性激活特性，cAMP增加时If通道开放速率增快。⑤它的单通道电导微弱，在细胞外钾离子浓度升高的情况下If的电导仅为1 pS，分布密度低，开放速度慢。If对胞外钾离子非常敏感，钾离子降到正常水平之下(2～4 mmol/L)即可引起电流幅度的显著降低。If对钾离子敏感有其生理学意义，比如，当心肌缺血时，If增大可改变心肌兴奋性。

3.3 通道在窦房结细胞自律性调节中的作用 自主神经刺激可改变If通道的电压依赖性，那么，自主神经递质是如何调节If的?通常认为，β-肾上腺能激动剂对心脏的正性变时作用是通过激活腺苷酸环化酶提高胞内cAMP水平，因此早期研究中曾提出cAMP作为第二信使调节If的假说。cAMP的这种直接作用就像自主神经递质的作用一样，并不改变If的最大激活电流，结果是改变舒张期除极的斜率和心率。通过胞内cAMP与If通道的直接作用而不是依赖于磷酸化作用，If激活曲线向正电压方向移动使舒张期的If内向电流增加，因而增大了舒张期去极化的斜率而使心率加快。

胆碱能激动剂通过对If的相反效应而负向移动激活曲线使舒张期的If内向电流减少，因而降低了舒张期除极的斜率而使心率减慢。儿茶酚胺和乙酰胆碱对If的作用在自主神经调节心率中起重要的作用。If通道是第一个可同时被电压、电压门控、cAMP结合、环腺苷酸门控等调节的例子［17，22，23］。

蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是公认的细胞内信号转导系统的关键酶之一，有多种生物活性，能使通道蛋白磷酸化，从而控制离子流变化［24］。在心肌细胞上，PKA可接受细胞膜上α及β肾上腺素受体激动等上游信号，本身被激活并通过磷酸化改变细胞膜上通道蛋白的构象，从而影响离子通道的门控动力学，最终改变通道电流［25］。

Huang等［26］很早就发现，心脏β肾上腺素受体能通过PKA信号转导通路调节离子通道来增加心率。但其分子机制尚未被很好地了解，过去认为β肾上腺素引起起搏电流兴奋性的调节通过cAMP和HCN4的直接连接，而不依赖于HCN4的磷酸化而实现，然而最近研究发现If兴奋调节中需要PKA的活性，PKA能直接磷酸化HCN4，If被认为是窦房结细胞 cAMP 信号的作用靶点［27］。Liao 等［28］等研究证明了PKA能够调节窦房结细胞HCN4通道。PKA抑制剂能明显降低β肾上腺素受体激动剂对鼠离体SNC电压依赖性If的改变。PKA也能使异源表达的HCN4通道电压依赖性向更正的电位改变。离体实验揭示PKA能够直接磷酸化HCN4上至少13个位点，包括N端至少3个残基和C端至少10个残基。被丙氨酸取代和截断的HCN4通道蛋白的功能分析确定了PKA调节位点在HCN4的C末端，这是PKA调节If所需要的，证明了HCN4通道可以被PKA所调控。因此，蛋白激酶A可直接对HCN4进行调节进而调节窦房结细胞的自律性。Lin等［29］等研究表明，HCN4通道可以被酪氨酸激酶磷酸化，酪氨酸磷酸化在HCN通道的调节中起着重要作用。酪氨酸磷酸化的增强或减弱可以导致HCN4表达的改变，其增强能提高窦房结细胞起搏电流的活动。

4 结语

If在心脏起搏活动中起着重要的作用，是保证心脏的节律性和规则性跳动、心脏正常生理功能的前提，If的失衡可能是各种心律失常相关疾病发生的离子基础之一，而If通道蛋白HCN4磷酸化水平的异常则可能是其分子基础之一，并受蛋白激酶A信号转导通路的影响。可以通过调控If达到对心脏起搏激动和节律调控作用，近年HCN通道的研究引起生物医学科学的重视，以期通过对该通道及If的研究，应用于心律失常疾病的治疗，使If及其通道蛋白成为药物的主要作用靶点。

［1］Stieber J，Hofmann F，Ludwig A.Pacemaker channels and sinus node arrhythmia［J］.Trends Cardiovasc Med，2004，14(1):23-28.

［2］Yerra L，Reddy PC.Effects of electromagnetic interference on implanted cardiac devices and their management［J］.Cardiol Rev，2007，15(6):304-309.

［3］Barbuti A，Difrancesco D.Control of cardiac rate by"funny"channels in health and disease［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1123:213-223.

［4］Brown HF，Difrancesco D，Nobel SJ.How dose adrenaline accelerate the heart?［J］.Nature，1979，280(5719):235-236.

［5］DiFrancesco D.The pacemaker current(If)Plays an important role in regulating SA node pacemaker activity［J］.Cardiovasc Res，1995，30(2):307-308.

［6］Zaza A，Robinson RB，DiFrancesco D.Basal response of the L-type Ca2+and hyperpolarized activated currents to autonomic agents in the rabbit S-A node［J］.J Physiol，1996，491:347-350.

［7］Barbuti A，Crespi A，Capilupo D，et al.Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46(3):343-351.

［8］张倩，宋治远，仝识非.线粒体KATP通道开放剂与缺氧预适应对乳鼠窦房结细胞起搏离子流作用的比较［J］.中国病理生理杂志，2006，22(10):1909-1912.

［9］Accili EA，Proenza C，Baruseotti M，et al.From funny current to HCN channels:20 years of excitation［J］.News Physiol Sci，2002，17(2):32-37.

［10］Dobrzynski H，Boyett MR，Anderson RH.New insights into pacemaker activity:promoting understanding of sick sinus syndrome［J］.Circulation，2007，115(14):1921-1932.

［11］Shi W，Wymore R，Yu H，et al.Distribution and prevalence of HCN mRNA expression in cardiac tissue［J］.Circ Res，1999，85(1):1-6.

［12］李海玲，徐亚伟.与心律失常相关的microRNAs研究现状［J］.国际心血管病杂志，2010，37(5):268-271.

［13］Stieber J，Herrmann S，Feil S.The hyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart［J］.Proc Nat Acadl Sci USA，2003，100(25):15235-15240.

［14］Baruscotti M，Difrancesco D.Pacemaker channels［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，1015(5):111-121.

［15］付勇，廖斌，于风旭，等.缺血再灌注损伤对在体兔窦房结细胞特异性通道蛋白表达的影响［J］.中国修复重建外科杂志，2009，23(7):856-860.

［16］Verkerk AO，van Ginneken AC，Wilders R.Pacemaker activity of the human sinoatrial node:role of the hyperpolarization-activated current，I(f)［J］.Int J Cardiol，2009，132(3):318-336.

［17］Giogetti A，Carloni P，Mistrik P，et al.A homology model of the pore region of HCN channels［J］.Biophys J，2005，89(2):932-944.

［18］Yu X，Chen XW，Zhou P，et al.Calcium influx through if channels in rat ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(3):C1147-1155.

［19］Chen J，Piper DR，Sanguinetti MC.Voltage sensing and activation gating of HCN pacemaker channels［J］.Trends Cadiovasc Med，2002，12(2):42-45.

［20］Robinson RB，Siegelbaum SA.Hyperpolarization-activated cation currents:from molecules to physiological function［J］.Ann Rev Physiol，2003，65(5):453-480.

［21］Verkerk AO，Wilders R，van Borren MM，et al.Pacemaker current I(f)in the human sinoatrial node［J］.Eur Heart J，2007，28(20):2472-2478.

［22］Accili EA，Robinson RB，DiFrancesco D.Properties and modulation of If in newborn versus adult cardiac SA node［J］.Am J Physiol，1997，272(3 Pt 2):H1549-H1552.

［23］Biel M，Schneider A，Wahl C.Cardiac HCN Channels，Structure，Function，and Modulation［J］.Trends Cardiovasc Med，2002，12(5):206-212.

［24］Aiello EA，Malcolm AT，Walsh MP，et al.Beta-adrenoceptor activation and PKA regulate delayed rectifier K+channels of vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol，1998，275(2 Pt 2):H448-H459.

［25］Kiehn J，Karle C，Thomas D，et al.HERG potassium channel activation is shifted by phorbol esters via proteinkinase A-dependent pathways［J］.J Biol Chem，1998，273(39):25285-25291.

［26］Huang XY，Morielli AD，Peralta EG.Molecular basis of cardiac potassium channel stimulation by protein kinase A［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(2):624-628.

［27］Liao Z，St Clair JR，Larson ED，et al.Myristoylated peptides potentiate the funny current(If)in sinoatrial myocytes［J］.Channels(Austin)，2011，5(2):115-119.

［28］Liao Z，Lockhead D，Larson ED，et al.Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node［J］.J Gen Physiol，2010，136(3):247-258.

［29］Lin YC，Huang J，Kan H，et al.Rescue of a trafficking defective human pacemaker channel via a novel mechanism:roles of Src，Fyn，and Yes tyrosine kinases［J］.J Biol Chem，2009，284(44):30433-30440.