冯宁，白亚磊，徐庆阳，谢希贤，陈宁

(天津科技大学生物工程学院，天津，300457)

氮源及其补加策略对L-缬氨酸发酵的影响*

冯宁，白亚磊，徐庆阳，谢希贤，陈宁

(天津科技大学生物工程学院，天津，300457)

通过分析黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的过程，得知在菌体生长期和快速产酸期氮源对L-缬氨酸发酵的影响不同。以黄色短杆菌XV0505为供试菌株，研究了不同氮源种类及不同氮源浓度对L-缬氨酸发酵过程的影响，选定了以豆饼水解液和硫酸铵为氮源，并确定了合适的初始氮源浓度。在初始氮源浓度相同的情况下，考察了间歇流加补氮策略、恒氮源浓度补氮策略和幂函数流加补氮策略对L-缬氨酸发酵的影响，研究发现，幂指数补氮策略可减少频繁的取样及铵浓度检测，在缺乏在线监测系统和反馈自控系统的情况下，将发酵体系中氮源浓度维持在合适值，既可适度促进菌体生长，又可使L-缬氨酸的产量得到进一步提高。在最优的氮源添加策略下，在30 L发酵罐发酵60 h，发酵液中L-缬氨酸可达63.17 g/L，糖酸转化率24.69%。

L-缬氨酸，氮源，补加策略，幂函数，黄色短杆菌

L-缬氨酸属于分支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人体八种必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于动物饲料、食品及调味剂和化妆品的制造，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。国内外大多采用微生物发酵法生产L-缬氨酸，具有原料成本低、反应条件温和及可大规模生产等优点［1］，发酵水平的高低是决定L-缬氨酸生产成本的主要因素。提高发酵水平的途径有2条:一是选育适合工业化生产的优良菌种，二是获得与生产菌种相匹配的最佳发酵工艺条件和控制手段［2］。然而，我国对于L-缬氨酸发酵的研究，长期以来侧重于高产菌的选育，对于发酵过程进行优化和控制的研究不多。

氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成L-缬氨酸氨基的重要组成成分，在L-缬氨酸发酵中的作用至关重要。但目前为止，对利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵生产L-缬氨酸的研究只集中于不同培养条件对其产量的影响，并没有系统研究氮源添加浓度和添加策略对发酵过程和菌体的单一及综合影响。本文采用黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸，研究表明，在菌体生长期和产酸期XV0505对氮源的需求有差异，因此，研究氮源添加浓度及其不同阶段氮源添加策略对黄色短杆菌发酵生产L-缬氨酸过程的影响，将为优化L-缬氨酸的生产提供有利的依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)XV0505(Leu－+Ile－+2－TAr+α －ABr+ +SGr)，天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种。

1.2 培养基(g/L)

1.2.1 活化斜面培养基

葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏 5，NaCl 2.5，琼脂条25，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.2 种子培养基

葡萄糖25，豆饼水解液10 mL，玉米浆20 mL，尿素1.2，酵母粉 4，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4· H2O 0.01，VB1300 μg，生物素 200 μg，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.3 基础摇瓶发酵培养基

葡萄糖 140，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素 100 μg，CaCO320(分消)，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.4 基础发酵罐发酵培养基

葡萄糖 80，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，Mn-SO4·H2O 0.01，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素 100 μg，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.3 培养方法

［3］。

1.4 分析方法

1.4.1 L-缬氨酸含量

应用高效液相分析系统测定。色谱分离条件:Agilent C18为色谱分离柱，2，4-二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAC溶液进行梯度洗脱，柱温33℃，流动相流量1 mL/min，检测波长360 nm。

1.4.2 菌体生物量

以菌体干重(DCW)表示，取10 mL发酵液，离心后用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中干燥至恒重，用分析天平称重。

1.4.3 葡萄糖浓度

应用生物传感仪 (SBA-40C，山东科学院生物研究所)测定。

1.4.4 NH4+浓度

应用多参数生化分析仪(Bioprofile300，美国Nova公司)测定。

2 结果与分析

2.1 分批发酵过程中不同氮源种类及浓度对XV0505菌体生长和L-缬氨酸产量的影响

发酵培养基一般采用含有快速和慢速利用的混合氮源，可以作为L-缬氨酸生产菌的无机氮源有氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、尿素及其他的含氮化合物，有机氮源有蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉等［1］。在基础发酵培养基中，以相同物质的量的氮为基准，研究了不同氮源对L-缬氨酸摇瓶发酵的影响，结果如表1。

表1 不同氮源对L-缬氨酸发酵的影响

由表1可知，从生物量的角度看，XV0505对豆饼水解液和玉米浆的利用效果都较好，硫酸铵作为氮源的效果也不错;从产酸的角度看，以豆饼水解液作为氮源，可获得较高的L-缬氨酸产量，无机氮源中则以硫酸铵为氮源时L-缬氨酸最高;从发酵时间上看，豆饼水解液能够缩短发酵周期，节约成本。豆饼水解液中含有丰富的生长因子和各种氨基酸，可为菌体的生长提供充分的营养物质，使菌体生长旺盛，利于L-缬氨酸的大量积累。而采用硫酸铵作为氮源不仅为菌体生长和发酵产酸提供氮元素，而且硫元素还可以供给L-缬氨酸合成途径中必需辅酶(如焦磷酸硫胺素、辅酶A和硫辛酸等)合成的需要，在代谢中起重要作用［2］。经综合考虑，确定以豆饼水解液和硫酸铵作为氮源。

2.2 分批补料发酵中氮源浓度对XV0505发酵生产L-缬氨酸的影响

2.2.1 不同豆饼水解液浓度对L-缬氨酸分批补料发酵的影响

在基础发酵培养基中分别添加2%、3%、4%和5%豆饼水解液，采用5 L发酵罐进行分批补料发酵，考察不同浓度有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响。结果见表2。

表2 不同豆饼水解液浓度下L-缬氨酸发酵结果的比较

由表2可知，4%豆饼水解液浓度对L-缬氨酸的发酵最有利。当豆饼水解液浓度为2%时，菌体干重和L-缬氨酸产量明显偏低，同时糖酸转化率和生产强度也较低。随着豆饼水解液浓度增加，各参数也相应增加，但当浓度提高至5%时，最终菌体干重和L-缬氨酸产量反而有所降低。由于豆饼水解液中含有XV0505菌株所必须的生长因子和各种氨基酸，若添加量不足，会影响菌体的正常生长，进而影响产量;添加过量，会导致前期菌体生长过快，造成后期活力不足，菌体生产能力降低，不利产酸。

2.2.2 不同硫酸铵浓度对L-缬氨酸的分批补料发酵的影响

用5L发酵罐进行分批补料发酵，分别添加150、225、300 和 375 mmol硫酸铵(NH4+)，从菌体生物量、产酸量、耗糖速率、糖酸转化率和单位菌体生产强度5个方面定量分析了不同硫酸铵浓度对XV0505发酵生产L-缬氨酸的影响，以及菌体对氮源的利用能力和需求情况，为进一步的氮源优化提供依据。结果见图1。

图1 不同初始(NH4)2SO4浓度对黄色短杆菌XV0505发酵L-缬氨酸的影响

由图 1可知，在整个发酵过程中，初始(NH4)2SO4浓度较低(75 mmol/L)时的菌体生长速率最高，耗糖较多，但L-缬氨酸的合成速率明显偏低，产量偏低，糖酸转化率和单位细胞生产强度均较低。随着氮源浓度的增加，菌体生物量增加，耗糖量较多，产量明显提高，糖酸转化率和单位细胞生产强度有所提高，当初始(NH4)2SO4浓度为225 mmol/L时，发酵效果最好，缬氨酸产量可达到55.19 g/L。而当初始(NH4)2SO4浓度为375 mmol/L时菌体生长受到抑制，菌体总生物量明显偏低，产酸量和耗糖量均较少，相对糖酸转化率和单位细胞生产强度也处于一个较低的水平。

综合以上结果可知，氮源初始浓度在发酵前期对菌体生长很重要，初始氮源浓度过高或过低都不利L-缬氨酸的合成。初始氮源浓度偏低时，虽有利菌体生长速率的提高和菌体量的增长，但过高菌体量导致进入产酸期时菌体的葡萄糖消耗速率偏低，菌体增长无力，活力不足，而且前期过高的菌体量导致发酵液粘度大，影响氧供应，产酸水平低［4］;而且氮源不足，无法为缬氨酸的合成提供足够的氨基。过高浓度的氮源在菌体快速生长期会抑制菌体生长，导致菌体量偏低;且高浓度的氮源在发酵前期产生的阻遏效应难以解除，导致产酸期菌体对NH4+的同化利用减少，无法提供足够氨基;另外，NH4+水平过高，还抑制菌体对葡萄糖的利用，降低发酵过程葡萄糖消耗速率，致使整个代谢途径碳架流量缺少［5］。可见，较低初始氮源浓度对L-缬氨酸发酵有利，但是随着氮源的消耗，会导致产酸期氮源浓度的不足，而且引起碳氮比的失衡，不利发酵的正常进行，因此，在较低初始氮源浓度的前提下，在产酸期进行一定氮源的添加，既可以有效解除高浓度的氮源对于菌体生长的抑制作用，又可以维持发酵过程中菌体产酸所需的氮源，有利于提高发酵强度和产酸水平。

2.3 氮源补加策略对L-缬氨酸发酵的影响

2.3.1 分批间歇流加补氮策略对L-缬氨酸分批补料发酵的影响

分批间歇流加氮源策略属于非反馈控制策略，它既可解决发酵过程中氮源耗竭和副产物积累等问题，又可满足菌体对氮源的需求。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵考察3种分批间歇补加氮源策略对L-缬氨酸发酵的影响。当发酵体系剩余的氮源浓度为50 mmol/L左右时(约36 h)开始补加，策略Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为每12 h、6 h、3 h补加 20 mL(NH4)2SO4。添加的(NH4)2SO4溶液浓度为264 g/L(每10 mL(NH4)2SO4溶液含有20 mmol/L NH4+)。发酵至60 h结束，其发酵过程曲线见图2。

图2 分批间歇流加氮源策略对XV0505发酵合成L-缬氨酸的影响

由图2可知，在发酵过程中，氮源添加的间隔越大，发酵体系中氮源浓度也就越高，菌体生长和产酸也就受到抑制，而且葡萄糖消耗量越大，导致副酸产量增大，糖酸转化率较低。氮源添加策略Ⅲ产酸量和糖酸转化率最高，分别达到57.08 g/L和23.03%，可见间歇流加氮源应是时间间隔越小对发酵越有利，而且主要副酸含量也会降低。当菌体生长进入稳定期后，耗氨速度减慢，此时一次性补入少量NH4+可刺激产酸;若一次性补入过多NH4+，发酵体系中过高的NH4

+浓度会影响物质代谢特征、物质传递体系中关键酶酶活和菌体内某些成分的生成，从而抑制菌体生长和产酸，且导致副产物积累［6－7］。因此，在总的氮源添加量相同的情况下，按照添加策略Ⅲ采多次少量分批补加氮源、维持较低浓度氮源的补氮方式，可解除了高浓度氮源对菌体生长和L-缬氨酸合成的抑制作用，又能维持了发酵中后期发酵体系中一定的氮源浓度，达到较好的发酵效果。

2.3.2 恒氮源维持浓度补氮策略对L-缬氨酸分批补料发酵的影响

研究表明，在菌体快速生长期和L-缬氨酸快速合成期这两个阶段，XV0505对氮源浓度的需求有差异。维持产酸期发酵过程中合适的氮源浓度可有效控制菌体比生长速率和L-缬氨酸的比合成速率，有效提高L-缬氨酸产量。前期研究表明，在L-缬氨酸快速合成期将碳氮比维持在14∶1～17∶1范围内时菌体生长和产酸效果最好，经过计算，最佳氮源浓度范围在24.9～38.1 mmol/L，而当碳氮比大于8∶1即氮源浓度大于62.5 mol/L时，菌体生长和产酸均受到强烈的抑制。恒氮源浓度补氮策略是一种简单直接的反馈控制方法，在相同初始氮源浓度下，当氮源浓度降至一定值时，按时间间隔不断取样进行氮源浓度(铵浓度)的离线测定，用人控方法反馈调节相应的补铵速率，将发酵体系中铵浓度维持在10 mmol/L、35 mmol/L、60 mmol/L，在30 L发酵罐上进行分批补料发酵，考察不同氮源维持浓度对L-缬氨酸发酵的影响，结果见图3。

图3 恒氮源维持浓度补氮策略对L-缬氨酸分批补料发酵的影响

由图3可知，在菌体生长期，3种氮源维持浓度下各发酵参数均相差不大;而在产酸期，维持发酵体系中铵浓度为35 mmol/L时菌体生物量和产酸量均较高，L-缬氨酸的积累水平可提高到60.32 g/L。氮源维持浓度较高(60 mmol/L)时，发酵体系中NH+4浓度水平过高，抑制菌体对葡萄糖的利用，致使整个代谢途径碳架流量缺少，L-缬氨酸合成量少［8］。氮源维持浓度较低(10 mmol/L)时，尽管菌体中L-缬氨酸合成酶系具有较好的酶活，由于铵离子的不足，α-酮戊二酸不能还原并氨基化，谷氨酸减少，无法为缬氨酸的合成提供足够的氨基，转氨基作用受阻，阻遏L-缬氨酸的合成;且在产酸明显减少的情况下，葡萄糖消耗速率仍维持相对较高的水平，这是由于缺少氮源，菌体消耗的葡萄糖大部分参与了菌体基本生理代谢，而仅有小部分参与L-缬氨酸的合成，导致L-缬氨酸合成受阻，影响产量。

由以上可知，用反馈控制方法流加硫酸铵使发酵体系中铵浓度维持在35 mmol左右，既为L-缬氨酸合成途径提供足够的氨基，又有效解除了过高的浓度发酵过程产生的不利影响，而且还避免了浓度的大幅波动引起的发酵不稳定性，使L-缬氨酸分批补料发酵到达较好的效果。

2.3.3 幂函数流加补氮策略对L-缬氨酸的分批补料发酵的影响

恒浓度反馈补氮策略使体系中氮源浓度按预设规律变化，能达到较高的发酵水平，但是需要人工频繁的取样和进行铵浓度离线测定，操作复杂，反馈滞后。因此，利用上述发酵条件下的四种流加速率变化进行曲线拟合，利用幂函数方程V=a·tb能较好地模拟发酵结果，其中，V是流加速率(mmol/h)，t为氮源流加时间(h)，a、b分别是方程参数。在一定发酵条件和浓度范围内，选择表3中相应的a、b值。在相同初始氮源浓度下进行L-缬氨酸的分批补料发酵，利用相应的幂函数方程随时间间隔控制硫酸铵的流加速率，将氮源浓度控制在35 mmol/L左右，发酵过程分析见图4。

表3 维持恒氮源浓度补料过程的幂函数方程

图4 幂函数补氮策略下L-缬氨酸分批补料发酵过程分析

从图4可以看出，采用幂函数补氮策略能够迅速及时调节铵离子补加速率，将铵浓度维持并稳定在菌体生长和发酵的最佳浓度(35 mmol/L左右)下，此时，L-缬氨酸的发酵效果最好。与其余两种补氮策略的最优情况相比，L-缬氨酸的产量和菌体生物量都得到有效地提高，分别达到63.17 g/L和24.72 g/L;发酵液中主要副酸(如乳酸、苏氨酸和丙氨酸)含量则相对较低，同时，糖酸转化率可达24.69%。

3 讨论与结论

前期相关研究表明，黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的过程属于半耦合型，即菌体生长与产酸有一定联系。在菌体生长阶段中提高菌体的生长密度，后一阶段强化L-缬氨酸的合成，将有助于提高整个发酵过程中L-缬氨酸的产酸水平［9］。合适的氮源及最佳初始添加浓度，对提高菌体生物量具有积极意义;而在产酸期补加一定量铵离子维持一定的碳氮比，有效保持菌体量的同时，还可为L-缬氨酸的合成提供足够氨基，强化目标产物的合成，提高产量。

黄色短杆菌XV0505可利用多种氮源促进菌体生长和合成L-缬氨酸，经摇瓶发酵验证，确定豆饼水解液和硫酸铵为最佳氮源。另外，研究了不同初始氮源浓度对L-缬氨酸发酵的影响，发现高浓度氮源对菌体生长和产物合成有抑制作用;氮源浓度过低则抑制菌体产酸。且由前期代谢流量分析表明［10］，在产酸期，初始氮源浓度过低或过高时，菌体内HMP途径受到抑制，流量较小，无法提供菌体生长所需要的戊糖和核酸等物质，而且产生的还原力NADPH较少，致使产酸受阻［11］;且TCA循环的流量相对较大，使得进入丙酮酸-缬氨酸合成途径的流量较少，导致L-缬氨酸合成速率也较小。因此，较低的初始氮源浓度对发酵最为有利，但随着氮源消耗碳氮比失衡，此时在维持一定葡萄糖浓度的同时也要补加一定氮源。由于NH4

+浓度的测定复杂且滞后，根据幂函数方程调节补氮速率，可将NH4+浓度控制在相应的恒定值，从而减少频繁的取样和离线测定，将较复杂的反馈型控制转化为较简单的非反馈型控制。在缺乏良好的在线监测系统和反馈自控系统的情况下，幂函数补氮策略近似的达到铵浓度的控制要求，可以实现氮源的限制培养，有效解除过高或过低氮源对发酵的不利影响，降低副产物的含量，提高糖酸转化率，为优化L-缬氨酸的生产提供有利的依据。

参考文献

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The Effect of Nitrogen Sources and Its Additional Strategies on L-valine Fermentation by Brevibacterium flavum XV0505

Feng Ning，Bai Ya-lei，Xu Qing-yang，Xie Xi-xian，Chen Ning
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin 300457，China)

By analyzing the L-valine fermentation process by Brevibacterium flavum XV0505，one of important factors influenced on the bacterial productivity and L-valine yield is nitrogen source and its additional strategies.The effect of nitrogen sources on the fermentation of L-valine was studied by adding different nitrogen sources with different concentrations.Therefore，soybean hydrolysates and ammonium sulfate were selected as the appropriate nitrogen source，and the best L-valine yield was obtained with the medium supplemented low initial concentration of 225 mmol/L.In the case of the same initial nitrogen concentration，the effects of three nitrogen feeding strategies(intermittent nitrogen feeding，constant concentration feeding and power function feeding)on biomass，yield of L-valine，concentration of byproduct and conversion rate were studied in the 30L fermentor.The result showed that the concentration and the feed rate of nitrogen source were effectively and timely manipulated by power function feeding，while lacking of online monitoring and feedback controlled system.The yield of L-valine was further improved up to 63.17 g/L by power function feeding strategy with the conversion rate of 24.69%.

L-valine，nitrogen sources，additional strategies，power function，brevibacterium flavum

硕士研究生(陈宁教授为通讯作者)。

*国家科技重大专项课题“企业新药物孵化基地建设”(2008ZX09401-05);天津市科技支撑计划重点项目(08ZCKFSH01900);天津市应用基础及前沿技术研究计划(08JCZDJC15400)

2010－11－22，改回日期:2010－12－23