马瑞娟 孙敏英 杨学习 徐伟文 (南方医科大学生物技术学院，广州510515)

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。人类IAPs的主要成员有X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、cIAP1、cIAP2、生存素 survivin、livin、神经元凋亡抑制蛋白NIAP等[1]。X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中的重要成员，是Liston等于1996年运用DNA印迹和聚合酶链反应(PCR)技术在人胚胎脑组织中克隆出的，其基因位于X染色体q24-25，含有497个氨基酸，分子质量为54 kD的蛋白质，其蛋白氨基端由3个BIR区域和羧基端1个环状锌指结构组成[2]。XIAP可以通过直接与 caspase-9、caspase-3、caspase-7结合来抑制caspase活性，从而抑制细胞凋亡的发生[3]。研究发现XIAP表达于大多数的肿瘤组织，而在正常组织中不表达，与肿瘤的进展、复发、预后以及肿瘤化疗的耐药性密切相关，可能是肿瘤诊治的新靶点[4-7]。本研究构建XIAP原核表达载体，在大肠杆菌中表达了XIAP重组蛋白并通过亲和层析纯化得到高质量的重组蛋白，免疫BALB/c小鼠，获得高效价多抗血清，希望能为人X染色体连锁凋亡抑制蛋白结构和功能的研究及诊断试剂的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 原核表达载体pET30a(+)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存;人XIAP重组载体pET30a(+)/XIAP由本实验构建;IPTG、考马斯亮蓝 R250和Kan购于Sigma公司;Ni-Separose填料购于GE公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达pET30a(+)和 pET30a(+)/XIAP转化的 BL21(DE3)单克隆于LB(Kan+)液体培养基中37℃，200 r/min过夜培养;次日以1∶200的比例转接于新的LB(Kan+)培养基中，于37℃、200 r/min培养至OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L继续培养4小时，同时设未诱导对照，离心收集菌体，取样用上样缓冲液悬浮沉淀后100℃煮沸5分钟，离心后取上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R250染色后观察结果。……