聂晓华,李建东,李焕荣,崔德凤,张 莉

(1.北京农学院动物科学技术学院,北京昌平102206;2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京海淀100097)

猪传染性胃肠炎(TGE)是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触传染性疾病,以仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为临床特征。该病毒主要编码纤突蛋白(S)、膜结合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(sM)4种结构蛋白[1-2]。其中S蛋白是惟一能诱导机体产生中和抗体的结构蛋白[3]。在S基因的近N端包含了4个主要的抗原决定位点A、B、C、D,其中诱导中和抗体产生的主要是 A位点[4]。此位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体[3]。本试验利用原核表达的TGEV S基因A位点重组蛋白免疫小鼠制备单抗,旨在为建立 TGEV准确快速的病原诊断,以及探索相关药物治疗效果研究奠定技术平台。

1 材料与方法

1.1 菌株、病毒、细胞及试验动物 表达TGEV S基因A位点蛋白的BL21(DE3)基因工程重组菌由本实验室构建并保存[5];TGEV河北分离株细胞毒、猪睾丸细胞(ST细胞)、骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存;BALB/c小鼠：北京海淀区兴隆实验动物养殖厂。

1.2 主要试剂 HAT和HT选择培养基、50%聚乙二醇1750购自Sigma公司;胎牛血清购自Hyclone;DMEM公司;高糖培养基购自Invirtrogen公司;HRP标记羊抗鼠IgG、FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 抗原的制备 表达TGEV S基因A位点蛋白的BL21(DE3)基因工程重组菌经IPTG诱导表达,经超声波裂解,提取包涵体,8 mol/L尿素对包涵体溶解,梯度复性后进行SDS-PAGE电泳纯化,获得重组A位点蛋白,-80℃冻存备用。

1.4 动物免疫 常规程序免疫8周龄健康BALB/c小鼠,第3次免疫14 d后尾静脉采血,测定抗体效价,选效价高的小鼠在细胞融合前3 d进行加强免疫。……