郑民强，邓炜，黄聪，张静

（贵阳中医学院药理教研室，贵州 贵阳 550002）

药理研究

两种黔产淫羊藿总黄酮对爪鼠学习记忆的对比研究△

郑民强，邓炜*，黄聪，张静

（贵阳中医学院药理教研室，贵州 贵阳 550002）

目的：研究贵州地方品种粗毛淫羊藿与黔岭淫羊藿中淫羊藿总黄酮（TFE）对化学药物诱导的痴呆小鼠模型学习记忆能力的影响，比较两种黔产淫羊藿TFE对小鼠学习记忆改善效果差异。方法：实验选用东莨菪碱、戊巴比妥、环磷酰胺3种化学药品分别复制出学习记忆损伤模型，按剂量1300，650 mg·kg－1灌胃TFE 14 d，采用Morris水迷宫实验，以定位航行实验和空间探索能力为指标进行其行为学检测。结果：两种TFE均能改善东莨菪碱等3种化学药物致痴呆小鼠学习记忆能力，且呈量效依赖关系。粗毛淫羊藿比黔岭淫羊藿改善记忆能力效果更好一些。结论：两种黔产淫羊藿TFE可明显改善东莨菪碱、戊巴比妥、环磷酰胺3种化学药物所致的空间记忆障碍，其效果与脑复康效果接近。两种TFE作用差异明显，粗毛淫羊藿优于黔岭淫羊藿。提示ICA是TFE中增强记忆的主要物质基础；同时也提示除了ICA外，TFE中尚有其他改善学习记忆的有效成分。

黔岭淫羊藿；粗毛淫羊藿；淫羊藿总黄酮，学习记忆；比较研究

黔产粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔岭淫羊藿E.leptorrhizumStearn为《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种，为淫羊藿常用中药及民族药品种。据调查，目前以淫羊藿为主要生产原料的贵州多家药厂及饮片配方仍以粗毛淫羊藿、黔岭淫羊藿等为主要来源。淫羊藿总黄酮（TFE）是淫羊藿主要药效成分，而淫羊藿苷（ICA）则是淫羊藿总黄酮中的主要药效物质基础。据研究报道贵州产多种淫羊藿其TFE、ICA含量均能达到或超过《中国药典》1995年版标准，但黔岭淫羊藿地上部分中ICA含量却很低，小于0.1%［1］，其药理作用与同属植物其他药用种是否存在差异，国内外未见报道。学习记忆能力减退是衰老和老年痴呆的共同临床表现，多种化学药品可致记忆缺失，现代研究发现TFE、ICA有益智，增强记忆作用［2，3］。本研究分别提取粗毛淫羊藿、黔岭淫羊藿总黄酮物质，对东莨菪碱、戊巴比妥、环磷酰胺致学习记忆损伤模型小鼠进行实验研究，比较两种药物对不同学习记忆障碍模型的改善作用之差异，以评价其药用价值。

1 材料

1.1 实验动物

昆明种健康小鼠，清洁级，体重（22±2）g，雌雄兼用，由贵阳医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（黔）2002-001。在实验条件下适应3 d后，进行试验。

1.2 药品

药材样品分别采自贵州贵阳市乌当区，贵州惠水县，经过贵阳中医学院何顺志教授准确鉴定为粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔岭淫羊藿E.leptorrhizumStearn。两种淫羊藿TFE提取：各取干燥淫羊藿茎叶1kg，照文献方法提取［4］，分别得总黄酮提取物32.28，27.44 g，得率为3.23%，2.74%；经紫外分光光度法测定其TFE含量以ICA计分别为58.4%，31.4%。分别用生理盐水制备成130，65 mg·mL－12个浓度为实验用药。

氢溴酸东莨菪碱（Scopolamine，Sco）注射液（广州明兴制药厂，批号：20070202）；环磷酰胺注射剂（Cyclophosphammide，Cy）（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：20081205）；戊巴比妥钠（pentobarbital，ptb）（分析纯）［中国医药（集团）上海化学试剂公司，批号：F20021216］；脑复康片（piracetam tablet，广州华南制药厂，批号：20080403）。

1.3 仪器

Morris水迷宫系统（中国医学科学院药物研究所）；DT-200电子天平（美国双杰集团常熟双杰测试仪器厂）。

2 方法

2.1 实验动物训练、筛选及实验

实验前须先对小鼠进行 Morris水迷宫训练。Morris水迷宫为一不锈钢圆柱形水池（120cm×50cm）和一可移动位置的圆柱形平台（10cm×24cm）组成。实验水深25cm（没过平台1cm），水温（23±2）℃，水中加入白乳化剂以遮隐平台。水池正上方摄像头与计算机连接，实验时对动物活动全程跟踪，可记录动物游泳轨迹、定位航行、逃避潜伏期、空间探索能力、航行距离以及游泳速度等指标。

本实验设定定位航行实验和空间探索能力2项指标为小鼠学习记忆能力判定指标。定位航行实验训练：将水池分成4个象限，在第一象限正中放置平台。分别将小鼠从第三象限面壁逐一放入水中，观察记录小鼠2min内寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期。2min内找到平台为合格动物，让动物于平台上停留10 s后取出。如果在2min内未找到平台，将其引至平台上，并停留10 s取出，再进行下一只。空间探索能力训练：移去平台，将小鼠从对侧象限面壁放入池中，记录小鼠2min内穿越平台位置的次数。将训练小鼠无明显智能差异者为合格留用，不合格者淘汰。正式实验时定位航行实验测试2次·d－1×3 d；空间探索能力测试 2次·d－1×2 d。

2.2 实验分组及给药

正式实验时每个实验分别取训练合格小鼠70只，随机分7组，为空白对照组，化学药物致记忆损伤模型组，脑复康阳性对照组500 mg·kg－1，粗毛TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）剂量组，黔岭TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）剂量组。除空白对照组及模型组给予等容积0.9%氯化钠溶液，各组均按剂量灌胃给药14 d。

2.2.1 两种TFE对小鼠东莨菪碱（Sco）所致的获得性记忆障碍的改善作用 于给药第9天起每天对各组小鼠（空白组除外）给予 Sco 2 mg·kg－1，ip，25min后，进行小鼠水迷宫实验，检测定位航行和空间探索能力，观察并记录数据。

2.2.2 两种TFE对小鼠戊巴比妥（ptb）所致的方向辨别障碍的保护作用 于给药第9天起每天对各组小鼠（空白组除外）给予 ptb 15 mg·kg－1，ip，25min后，进行小鼠水迷宫实验，检测定位航行和空间探索能力，观察并记录数据。

2.2.3 两种TFE对环磷酰胺（Cy）诱导小鼠学习和记忆障碍的影响 于给药第9天对各组小鼠（空白组除外）给予 Cy 80 mg·kg－1，ip，造成学习记忆障碍的动物模型，1 h后，采用水迷宫法检测小鼠定位航行和空间探索能力，连续5 d，观察并记录数据。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 两种TFE对Sco小鼠获得性记忆障碍的改善作用

结果见表1。

表1 两种TFE对Sco小鼠学习记忆的影响（±s）

表1 两种TFE对Sco小鼠学习记忆的影响（±s）

注：（1）n＝10；（2）与对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／mg·kg逃避潜伏期／s 跨越平台次数／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.95 8.83±2.25 Sco模型组 2 91.62±22.74▲▲ 93.61±28.47▲▲ 96.72±27.12▲▲ 4.49±1.34▲▲ 3.67±0.89▲▲脑复康＋Sco 500＋2 68.38±10.51** 63.55±18.96** 65.42±22.53** 6.68±2.06** 5.00±2.00*粗毛TFE高＋Sco 1300＋2 53.59±21.98** 57.60±25.37** 68.42±22.11** 6.26±1.64** 5.25±2.22**粗毛TFE低＋Sco 650＋2 67.16±23.29** 66.97±22.39** 76.86±16.26* 5.60±1.57* 5.75±2.41**黔岭TFE高＋Sco 1300＋2 69.05±19.89** 78.57±25.47* 66.17±15.35** 6.70±1.27** 5.30±1.81**黔岭TFE低＋Sco 650＋2 74.12±11.84* 78.38±1.92* 74.03±29.25* 5.39±1.73* 5.80±1.66空白对照组 42.15±19.90 43.84±24.44 53.32±19.30 9.94±2**

表1显示，与正常对照组比较，模型组逃避潜伏期明显增加，跨越平台次数显著减少（P＜0.01），说明东莨菪碱可造成小鼠空间记忆障碍。与模型组比较，两种TFE高、低剂量组小鼠水迷宫游泳逃避潜伏期均显著减少，跨越平台次数显著增加，与脑复康组没有显著差别；两种TFE高剂量组疗效较好，说明有量效依赖性；粗毛淫羊藿显示出更为明显的效应。提示2种黔产TFE均可对抗2 mg·kg－1东莨菪碱所造成的小鼠学习记忆获得障碍，能提高定位航行和空间探索能力，对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍具有明显的改善作用。

3.2 两种TFE对ptb小鼠方向辨别障碍的保护作用

结果见表2。

表2 两种TFE对ptb小鼠方向辨别障碍的保护作用±s）

表2 两种TFE对ptb小鼠方向辨别障碍的保护作用±s）

注：（1）n＝10；（2）与对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／mg·kg逃避潜伏期／s 跨越平台次数／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天13 7.12±1.10 ptb模型组 15 102.24±21.13▲▲ 97.24±21.46▲▲ 96.23±18.14▲▲ 3.14±1.19▲▲ 3.18±1.13▲▲脑复康＋ptb 500＋15 61.46±21.27**66.84±15.43** 68.90±11.49** 5.19±1.13** 5.18±1.16**粗毛TFE高＋ptb 1300＋15 59.38±21.18**61.27±14.27** 66.87±17.13** 5.17±1.53** 5.24±1.71**粗毛TFE低＋ptb 650＋15 69.51±31.05**75.23±21.51* 78.19±12.19* 4.81±1.14** 5.13±1.62**黔岭TFE高＋ptb 1300＋15 64.31±24.22**77.42±29.68* 65.33±10.21** 4.73±2.44* 5.01±2.87*黔岭TFE低＋ptb 650＋15 73.24±15.07**76.54±27.30* 76.52±20.03* 4.24±1.76* 4.17±1.53空白对照组 46.89±31.0 51.81±17.22 55.16±11.70 8.17±1.*

巴比妥对中枢神经系统具有显著的抑制作用，可导致方向辨别障碍。表2结果显示，与空白对照组比较，ptb模型组逃避潜伏期明显增加，跨越平台次数显著减少（P＜0.01），提示小鼠记忆障碍模型形成。连续给药14 d后，与模型组比较两种TFE高、低剂量组小鼠游泳逃避潜伏期均显著减少，跨越平台次数显著增加，与阳性药组差异不明显；两种TFE高剂量组疗效较好，呈明显量效依赖。表明TFE可明显提高ptb小鼠正确辨别方向的能力，对ptb小鼠所致的方向辨别障碍有一定的改善和保护作用。本实验粗毛淫羊藿疗效优于黔岭淫羊藿。

3.3 两种TFE对Cy小鼠学习记忆障碍的影响

结果见表3。

本实验结果与文献［5］报道一致，Cy可使小鼠学习记忆缺失，与正常对照组比较，Cy模型组逃避潜伏期明显增加，跨越平台次数显著减少（P＜0.01），提示小鼠记忆障碍形成。TFE的促智作用已有报道［2］，但探讨TFE对Cy诱导小鼠学习记忆缺失的影响未见报道。表3研究结果表明，与Cy组比较，TFE可使Cy小鼠逃避潜伏期明显缩短，跨越平台次数显著增加，尤以粗毛淫羊藿作用显著（P＜0.01），与脑复康组没有明显差别，提示两种TFE都能提高Cy小鼠定位航行和空间探索能力，对Cy小鼠学习记忆障碍有明显的改善作用，以粗毛淫羊藿效果为好。

表3 两种TFE对Cy小鼠学习记忆的影响（±s）

表3 两种TFE对Cy小鼠学习记忆的影响（±s）

注：（1）n＝10；（2）与对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／mg·kg逃避潜伏期／s 跨越平台次数／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.08 8.16±1.11 Cy模型组 80 102.47±29.35▲▲ 93.63±16.63▲▲ 103.11±26.02▲▲ 4.26±2.07▲▲ 4.73±1.24▲▲脑复康＋Cy 500＋80 70.35±17.11**61.42±14.28** 78.91±27.03**7.29±2.53** 6.71±1.36**粗毛TFE高＋Cy 1300＋80 68.14±40.44**56.64±23.37** 76.33±24.17**6.58±1.76** 6.25±1.52**粗毛TFE低＋Cy 650＋80 74.13±43.21* 69.37±18.09** 68.33±22.16**5.51±1.42* 5.79±1.10*黔岭TFE高＋Cy 1300＋80 64.25±44.06**59.43±17.12** 67.11±20.29**7.36±2.75** 5.74±1.27*黔岭TFE低＋Cy 650＋80 83.52±15.78* 75.87±15.14* 72.35±13.43**空白对照组 64.16±10.18 42.70±18.45 59.78±27.93 8.44±24.99±3.08 4.78±1.61

4 讨论

改善学习、增强记忆功能是评价药物抗痴呆有效性的重要指标［6］，据研究，改善动物学习和记忆能力的药物对治疗人类痴呆症同样有效。现代药理研究表明，淫羊藿在骨质代谢、心血管系统、免疫系统、中枢神经系统等具有多方面的显著生物学活性，TFE是这些功能的有效成分，而ICA则是TFE中主要药效物质基础［7］。黔岭淫羊藿地上部分因ICA含量极少，不主张作为药用品［1］，但缺乏相关的药效依据支撑。本研究以小鼠空间记忆能力为指标，比较研究两种黔产淫羊藿TFE对改善小鼠认知功能的作用，结果证明两者均有较好的作用。

人的记忆思维与中枢胆碱能神经功能密切相关，海马及其环路功能遭受破坏，会发生近期记忆障碍［6］。东莨菪碱作为中枢胆碱能受体拮抗剂，可降低大脑皮质和海马胆碱能系统活性，对记忆获得产生阻抑效应。本实验采用测试前给药观察到两种TFE可对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍，提示可能与胆碱能神经功能改善有关。但目前的研究还缺乏证据证明TFE如何改善胆碱能神经，是否提高乙酰胆碱的含量和胆碱受体功能。巴比妥通过影响中枢GABA能神经功能，产生中枢抑制作用，可导致方向辨别障碍。研究揭示［7］齿状回GABA能神经减少越明显，老年学习记忆损害越严重。本研究结果表明TFE对戊巴比妥钠引起的小鼠方向辨别障碍有一定的保护作用，与模型组比较具有明显的差异，以高剂量组作用较强；粗毛淫羊藿显示出更为明显的差异。这是否是通过增加齿状回GABA能神经来改善记忆障碍，有待深入研究。环磷酰胺通过与DNA交叉联结，干扰RNA转录而抑制蛋白质合成，环磷酰胺能导致记忆缺失，可能与脑内新蛋白质的合成减少密切相关［8］。两种TFE对环磷酰胺所造成的记忆巩固缺陷有改善作用，是否与TFE促进蛋白质合成作用有关，有待进一步研究。

两种淫羊藿总黄酮均可对抗东莨菪碱、戊巴比妥、环磷酰胺3种化学药物所致的记忆障碍，明显改善记忆功能，且呈量效依赖性，提示本品具有易化记忆、提高智力和减缓智力衰退作用。从3个实验结果看，粗毛淫羊藿TFE改善记忆作用明显优于黔岭淫羊藿TFE，提示ICA可能是TFE中主要增强记忆的物质基础；同时也提示TFE中除了ICA外，尚有其他改善学习记忆的有效成分。

［1］何顺治，郭宝林.贵州产淫羊藿的质量研究［J］.药物分析杂志，1996，16（5）：291.

［2］蒋淑君，杨丽娟，许勇，等.淫羊藿总黄酮对痴呆模型大鼠学习记忆功能及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响［J］.中国现代医学杂志，2008，18（23）：26.

［3］张翔南，王欢欢，王志强，等.淫羊藿素抗Aβ肽致大鼠原代培养神经细胞凋亡作用［J］.浙江大学学报（医学版），2007，36（3）：223.

［4］宋剑，王超，李知遥，等.淫羊蕾总黄酮抗老年痴呆化学成分研究［J］.中国现代中药，2009，11（8）：23.

［5］明亮，张艳.环磷酰胺引起小鼠学习记忆缺失模型初探［J］.中国药理学通报，1998，14（4）：376.

［6］温中京，陈海委.中药石菖蒲提取物对记忆障碍小鼠模型的改善作用研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（10）：2203.

［7］柯尊记.老年学习记忆减退的神经行为学基础［J］.生理科学进展，1997，28（4）：328.

［8］温富春，许家洁，王玉红，等.安神补脑液对小鼠学习记忆能力及脑内蛋白质合成的影响［J］.中国中医药信息杂志，2007，14（8）：23.

Comparative Study on TFE of Two Species of Epimedium in Guizhou on the Learning Memory Disorder

ZHENG min-qiang，DENG Wei，HUANG Cong，ZHANG Jing
（Dept.of Pharmacology Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China）

Objective：Study on the effect of TFE in Epimedium acuminatum and E.leptorrhizum in Guizhou to learning-memory impairment model mice induced by scopolamine chemical substances etc.Methods：To set up memory disorder mice by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide were injecting intraperitoneal and by TFE of two species of 1300，650 mg·kg－1×14 d from the mice ig.The Morris Water Maze was used to check directional navigation experiments and space exploration experiments.Results：The two species of TFE have an obvious improved for three different memory disorder mice induced by scopolamine etc.and both of the 2 species of TFE showed concentration-response dependence.Among them，The effect of improve the learning and memorizing ability inmice，the TFE of E.acuminatum is better.Conclusion：Both the TFE the 2 species of Epimedium in Guizhou could obviously improved of space learingmemory disorder by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide.Their effect is similar with the Piracetam Tablets.E.acuminatum superior to E.leptorrhizum and there is great difference between them.The results suggest that the ICA is the main substance improve memory.Also hints，may be there′s another bioactive components of improvememory except the ICA in TFE.

Epimedium leptorrhizum；E.acuminatum；TFE；Learning and memory；Comparative study

贵阳中医学院科研项目（2008-01-15）

*邓炜，E-mail：dengwei0517＠yahoo.cn

2010-08-27）