何培新，秦慧迪，刘林飞，吴睿睿

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）

食用牛肝菌抽提物最佳提取工艺的研究

何培新，秦慧迪，刘林飞，吴睿睿

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）

以食用牛肝菌为原料，在单因素实验的基础上，采用正交实验，研究了外加蛋白酶和纤维素酶辅助抽提风味物质的最佳工艺。结果表明，最佳工艺条件为：液固比8（mL/g）、提取pH6.0、酸性蛋白酶与纤维素酶酶活比400/150、水解温度60℃、水解时间90min。采用最佳工艺抽提牛肝菌，抽提物中总氮含量1.519%，氨基氮含量0.300%，蛋白质水解率19.75%，固形物提取率28.89%。

牛肝菌，风味物质，单因素实验，正交设计

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用牛肝菌 购买于郑州市调味品城，原产地为云南省昆明市，含水量86.8%；酸性蛋白酶（5万U/g）、纤维素酶（4万U/g） 无锡市雪梅酶制剂科技有限公司。

GF-1高速组织匀浆仪 北京众益中和生物技术有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SP-2100(723)型分光光度仪 上海光谱仪器有限公司；BS200S型电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；coolsafe 55-4型真空冷冻干燥器 丹麦Scanlaf公司；SHB-3循环水环多用真空泵 郑州杜甫仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 原料→粉碎→调配→恒温水解→灭酶→过滤→上清液真空浓缩→真空冷冻干燥→抽提物粉末

1.2.2 分析方法 总氮测定采取凯氏定氮法进行，总氮含量×6.25计算为总蛋白质含量[7]；氨基氮测定参照杜善良和张文德报道的方法[8]；蛋白水解率（%）=（提取液中氨基氮/提取液中总氮）×100%；固形物提取率（%）=（提取物干重/样品干重）×100%。

1.2.3 单因素实验 以提取液中氨基氮含量（%，w/w干重）为衡量指标，利用牛肝菌自身酶系作用，在pH6.0、水解温度60℃、水解时间90min条件下探讨了液固比（4、6、8mL/g）对抽提的影响；液固比为6mL/g时，探讨了水解时间（60、90、120min）对抽提的影响；在液固比6mL/g、pH6.0、水解温度60℃、水解时间90min条件下探讨了外加蛋白酶活力（300、400、500U/mL）和纤维素酶活力（100、150、200U/mL）对抽提的影响。

1.2.4 正交实验 考虑两种酶制剂作用的适宜温度（55～65℃）和pH6.0比较一致，在单因素实验的基础上，选取液固比、水解时间和蛋白酶/纤维素酶酶活比3个因素，每个因素3水平设计正交实验如表1。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 液固比对抽提的影响 液固比对牛肝菌抽提的影响见图1。从图1可以看出，在pH6.0、水解温度60℃、水解时间90min条件下，抽提物中氨基氮的含量随液固比的增加而增大，当液固比为6mL/g时氨基氮的量已趋于平缓。考虑到液固比过大难以有效增加氨基氮的溶出量，而且还会增加抽提液浓缩的成本，确定抽提的液固比为6mL/g。

图1 液固比对牛肝菌抽提的影响

图2 水解时间对牛肝菌抽提的影响

2.1.2 水解时间对抽提的影响 水解时间对牛肝菌抽提的影响见图2。从图2可以看出，在pH6.0、水解温度60℃、水解时间90min条件下，抽提液中氨基氮含量大于水解60min抽提液中氨基氮含量，但与水解120min条件下抽提液中氨基氮含量差异不明显，因此选择水解时间90min。

2.1.3 添加蛋白酶对抽提的影响 添加蛋白酶对牛肝菌抽提的影响见图3。从图3可以看出，不添加蛋白酶，抽提液中氨基氮含量较低，添加400U/mL蛋白酶，抽提液中氨基氮含量最大，表明添加蛋白酶可有效帮助细胞自溶，有利于胞内物质的释放，蛋白酶添加量以400U/mL为宜。

图3 添加蛋白酶对牛肝菌抽提的影响

2.1.4 添加纤维素酶对抽提的影响 添加纤维素酶对牛肝菌抽提的影响见图4。从图4可以看出，添加一定活力的纤维素酶，可有效增加抽提液氨基氮的含量；纤维素酶添加量为150U/mL时，抽提液中氨基氮的含量最大，继续增大酶用量难以有效提高抽提液的氨基氮含量，故应选择添加纤维素酶活力150U/mL为宜。

图4 添加纤维素酶对牛肝菌抽提的影响

2.2 正交实验

每个实验编号称取2g牛肝菌，提取后测定抽提液中的氨基氮含量（表2）。从表2可以看出，影响抽提效果的因素大小为：液固比＞水解时间＞酶活比；最佳抽提条件为A3B2C2，即液固比8mL/g，水解时间90min，蛋白酶/纤维素酶酶活比400/150。

2.3 最佳工艺抽提效果

称取20g牛肝菌粉末，采用优化后的最佳工艺条件抽提。真空冷冻干燥后，抽提物为褐色粉末，香气浓郁，风味独特。产品总氮含量为1.519%，总蛋白含量为9.49%，氨基氮含量为0.300%，蛋白水解率为19.75%，固形物提取率为28.89%。

3 结论

牛肝菌经优化工艺液固比8mL/g、提取pH6.0、添加酸性蛋白酶与纤维素酶酶活比400/150、水解温度60℃、水解时间90min提取后，抽提物中总氮含量为1.519%，氨基氮含量为0.300%，蛋白质水解率为19.75%，固形物提取率为28.89%。抽提物香气浓郁，风味独特，可以用来复配生产高质量菇精类产品，也可作为食品添加剂使用。风味物质抽提拓展了食用野生牛肝菌的应用领域，可提高野生菌产业的附加值。

表2 正交实验结果

[1]李泰辉，宋斌.中国食用牛肝菌的种类及其分布[J].食用菌学报，2002,9（2）：22-30.

[2]刘佳，殷忠，高敏，等.野生牛肝菌的化学成分分析及遗传毒理研究[J].微量元素与健康研究，2007，24（3）：3-5.

[3]周玲仙，殷建忠.云南野生食用牛肝菌营养成分分析及评价[J].食用菌，2008（4）：61-62.

[4]赵谋明，郑克平.草菇抽提物最佳提取工艺条件的研究[J].食品工业科技，1997，18(2):35-39.

[5]邵伟，乐超银，涂志英.蘑菇抽提物工艺研究及菇精的制备[J].中国酿造，2008（16）：102-103.

[6]宋超.金针菇精生产技术[J].食品工业，1994(2):35-37.

[7]张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术(第2版)[M].北京：高等教育出版社，1997：138-140.

[8]杜善良，张文德.一种快速测定调味品中氨基酸态氮的新方法[J].中国调味品，1998（1）：30-31，6.

Study on the best technology of preparation of flavor extracts from byproducts of Boletus mushrooms

HE Pei-xin,QIN Hui-di,LIU Lin-fei,WU Rui-rui
（School of Food and Biological engineering,Zhengzhou Institute of Light Industry,Zhengzhou 450002,China）

Using edible BoIetus mushrooms as material，based on investigations of single factors，the best technology of preparation of flavor extracts was studied by orthogonal design.The results suggested that the best technology was:ratio of dosage liqueur 8，extraction pH 6.0，activities of mixed protease and cellulose 400/150，extraction temperature 60℃ and extraction time 90min.Under the best technology，the extracts contained (in dry weight)1.519%total nitrogen，0.300%amino nitrogen，and the hydrolytic rate of protein and solids extraction rate was 19.75%and 28.89%，respectively.

BoIetus mushrooms；flavor substances；single-factor investigation；orthogonal design

TS219

B

1002-0306（2011）10-0335-03

牛肝菌是牛肝菌目（Boletales）中具菌管或菌褶类群的种类，多达28属，397种或变种，其中199种可食。中国牛肝菌种质资源非常丰富，尤以我国西南和华南地区食用牛肝菌资源最为丰富[1]。牛肝菌为菌根菌，目前尚不能人工栽培。野生牛肝菌子实体粘软多汁，香滑可口，富含蛋白质、维生素、多糖类物质、氨基酸和多种矿物元素，其提取物具有增强免疫力、抗癌、抗辐射等功能[2]。据周玲仙和殷建忠测定，云南野生的小美牛肝菌（见手青）（Boletus speciosus）、美味牛肝菌（白牛肝）（B.edulis）等4种牛肝菌具有高蛋白、低脂肪和低热量的特点，含有丰富的钾元素，维生素B2含量较高，呈鲜味的谷氨酸和天门冬氨酸含量丰富，占氨基酸总量的20.6%～31.7%[3]。近年来，随着人们生活水平的提高和消费观念的改变，提取食用菌风味物质，与其他调味原料复配生产的新一代调味品—菇精大受欢迎，市场前景广阔。国内已经进行了从草菇（Volvariella volvacea）[4]、双孢蘑菇（Agaricusbisporus）[5]、金针菇（Flammulina velutipes）[6]等食用菌子实体提取风味物质的研究，但没有见到牛肝菌的相关研究报道。本文探讨了以可食野生牛肝菌为原料，外加蛋白酶和纤维素酶辅助提取风味物质的工艺技术，为生产风味独特、具有保健和药用价值的高质量菇精产品和食品添加剂奠定基础。

2010-06-28

何培新（1970-），男，副教授，博士，主要从事应用真菌研究。

中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCXZ-YW-N-46-02-04）。