侯佰立，吉宏武，*，王 燕，蓝尉冰

（1.水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524025）

凡纳滨对虾虾头制备甲壳素工艺的研究

侯佰立1，2，吉宏武1，2，*，王 燕1，2，蓝尉冰1，2

（1.水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524025）

采用自溶法对凡纳滨对虾虾头脱除蛋白质后，研究螯合剂脱钙制备甲壳素的工艺条件。以脱钙率为考察指标，依据单因素实验结果，采用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法考察螯合剂EDTA·Na2浓度、反应时间和pH对脱钙率的影响。实验结果表明，EDTA·Na2螯合脱钙最佳工艺条件为：EDTA·Na2浓度9%（m/V），反应时间2.5h，pH8.0，在此条件下脱钙率为99.56%±0.06%。

凡纳滨对虾虾头，甲壳素，制备工艺，响应面法

1 材料与方法

1.1 材料与设备

凡纳滨对虾虾头 广东省湛江市国联水产开发股份有限公司；草酸铵 广东光华化学厂有限公司，分析纯；高锰酸钾、乙二胺四乙酸二钠（EDTA·Na2）广州化学试剂厂，分析纯；乙二胺四亚甲基膦酸五钠（EDTMP·Na5） 山东泰和水处理公司，分析纯。

3-550PD型程控高温炉 配有自动门，美国VULCAN公司；501S型超级恒温水槽 配有微电脑智能控温仪和内置循环水泵，中国上海跃进医疗器械厂；FW-80型高速万能粉碎机 配有全不锈钢工作室，中国北京市永光明医疗仪器厂；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 配有由聚四氟乙烯和优质磁钢制成的搅拌子，中国巩义市英峪予华仪器厂；GZX-9246MBE型数显鼓风干燥箱 配有微电脑控温系统和空气对流微风装置，中国上海博迅实业有限公司医疗设备厂；M3B009型恒温振荡器 中国太仓市科教器材厂；HOI-IB型数显恒温磁力搅拌器配有无刷直流电机，中国上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；EYELAA-1000S型水流抽气机 日本东京理化器械。

1.2 实验方法

1.2.1 脱蛋白虾粉的制备 称取207g凡纳滨对虾虾头，加入蒸馏水900mL，即料液比为23%（m/V），用均质机将其打碎后，放入超级恒温水槽以40～65℃（每30min升高5℃）梯度升温处理，3h后取出，用蒸馏水洗净脱蛋白后的残渣，将其放入数显鼓风干燥箱烘干。之后，冷却取出，经高速万能粉碎机粉碎，制得40目以上的脱蛋白虾粉，存放于干燥器内备用。

1.2.2 脱蛋白率及脱蛋白虾粉钙含量的测定

1.2.2.1 粗蛋白含量的测定 凯氏定氮法[13]。

式（1）中：W—以质量分数表示的脱蛋白率，%；M—脱蛋白虾粉的质量，g；M1—原虾头的质量，g；M2—由M1g虾头所制得的脱蛋白虾粉的总量，g；X—以质量分数表示的原虾头中蛋白含量，%；Y—以质量分数表示的脱蛋白虾粉中蛋白含量，%。

1.2.2.2 灰分的测定 参照文献[14]。

1.2.2.3 脱蛋白虾粉钙含量的测定 参照文献[15]。

1.2.3 螯合法脱钙的工艺条件研究

1.2.3.1 螯合剂筛选 由于EDTA不溶于冷水，在室温条件下溶解性极差，故考虑选择其他螯合剂。根据筛选，确定EDTA·Na2和EDTMP·Na5两种螯合剂进行比较实验。比较实验的工艺条件如下：

工艺1：pH13，13%（m/V）EDTA·Na2溶液室温浸泡至无气泡产生，其间不停搅拌。

工艺2：pH9，EDTA·Na2饱和溶液室温浸泡至无气泡产生，其间不停搅拌。

工艺3：39%（m/V）EDTMP·Na5水溶液（pH6.11）室温（25℃）下浸泡至无气泡产生，其间不停搅拌。

工艺4：39%（m/V）EDTMP·Na5酸溶液（pH4.04）室温（25℃）下浸泡至无气泡产生，其间不停搅拌。

每个工艺均平行操作3次，实验结果取平均值。

1.2.3.2 响应面分析法优化工艺条件的研究 准确称取3.00g脱蛋白虾粉，加入不同pH（8、9、10、11、12、 13）、不同浓度（1%、3%、5%、7%、9%、11%）的EDTA· Na2溶液100mL，于25℃，振荡速度为125r/min条件下振荡反应一定时间（0.5、2.5、4.5、6.5、8.5、10.5h），取出样品，抽滤洗涤至中性。滤渣烘干，由定性滤纸上小心刮下，无损失地转移至坩埚，灰化完全后取出。参照文献[15]测定钙含量，并计算脱钙率。

根据单因素实验结果（未列出），选择螯合剂浓度（A）、反应时间（B）、pH（C）为考察因素，脱钙率为响应值进行响应面优化，因素水平编码表见表1。

表1 因素水平编码表

实验以随机次序进行，重复3次，结果用Design Expert软件进行回归分析。

1.2.3.3 废液中EDTA的回收 收集含EDTA的脱钙废液，用1∶1 HCl调节其pH=1，从而令EDTA以酸的形式沉淀，过滤，用少量0.1mol/L HCl洗涤沉淀表面吸附的钙和蛋白质后回收。

2 结果与讨论

2.1 螯合剂筛选

两种螯合剂的脱钙效果如表2所示。

表2 螯合剂比较实验结果

实验结果显示，浓度为39%的EDTMP·Na5溶液在中性条件下与浓度为13%的EDTA·Na2溶液在碱性条件下的脱钙率均达到99%以上，并无明显差别，而各自优缺点明显，EDTMP·Na5中性条件下与水混溶，但回收方法尚不明确，且价格较EDTA·Na2昂贵，脱钙效果无明显优势。基于以上分析，实验确定采用EDTA·Na2进行螯合脱钙。

2.2 脱钙工艺参数的优化

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，并用统计软件Design Expert 7.0对实验数据进行回归分析。

2.2.1 响应面实验结果 响应面实验结果如表3所示。

2.2.2 响应面实验数据分析 以脱蛋白虾粉的脱钙率为响应值，根据表3的实验结果，用Design Expert 7.0统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表4、表5。可以看出各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可用回归方程表示为：

表3 响应面中心组合设计实验结果

根据上述回归方程作出响应面分析图，见图1～图3，Y为脱蛋白虾粉的脱钙率（%）。

图1 浓度（A）与时间（B）交互作用对脱钙率的影响

图2 浓度（A）与pH（C）交互作用对脱钙率的影响

回归模型的决定系数为98.82%，说明模型的回归性是极显著的。模型显著，失拟项不显著，表明模型与实际情况拟合较好，可用此模型对实验进行分析和预测。

图3 时间（B）与pH（C）交互作用对脱钙率的影响

表4 回归模型方差分析表

表5 回归方程系数显著性检验

2.2.3 寻取最优值 为确定各因素的最佳取值，可以利用Design Expert7.0软件进行分析，得出回归模型存在最大值点，Y的最大估计值为99.72%，与之对应的自变量实际值为EDTA·Na2浓度（A）9%，时间（B）2.49h，pH（C）8.0。为实际操作方便，选取EDTA·Na2浓度（A）9%，时间（B）2.5h，pH（C）8.0，在此优化条件下共进行3次平行验证实验，结果见表6。

表6 脱钙验证实验结果

2.3 废液中EDTA的回收

回收得到EDTA酸沉淀，经测定回收率为100%。将其配制为一定浓度、pH的EDTA溶液后可再用于虾头脱钙处理，实现了EDTA的重复利用。

3 结论

以凡纳滨对虾虾头为原料，采用自溶法脱蛋白和EDTA·Na2螯合脱钙制备甲壳素的工艺是可行的。自溶法脱蛋白对环境无污染，耗能量较小，成本低，其蛋白质水解液可回收生产海鲜调味料，蛋白质脱除率高达83.16%±0.03%，脱蛋白虾粉的钙含量为13.21%±0.01%。

EDTA·Na2螯合脱钙相较于传统稀酸脱钙，具有污染小、成本较低、操作步骤简单、生产周期短等优点，通过响应面优化法得到脱钙最佳工艺条件为：EDTA·Na2浓度为9%（m/V），反应时间为2.5h，pH为8.0，在此条件下脱钙率为99.56%±0.06%。

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Study on preparation technology of chitin from Penaeus vannamei shrimp head

HOU Bai-li1，2,JI Hong-wu1，2，*,WANG Yan1，2,LAN Wei-bing1，2
（1.KeyLaboratoryofAquaticProductAdvancedProcessingofGuangdongHigherEducationInstitutes,Zhanjiang524088,China；2.College of Food Science&Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China）

After deproteinization by autolysis method，the preparation technology of chitin from Penaeus vannamei shrimp head by decalcifying with chelating agent was studied.On the basis of single-factor tests，decalcification rate was used to evaluate the performance of chelating agent(EDTA·Na2)concentration，decalcifying time and pH on decalcification rate by using Box-Behnken center composite design and response surface methodology. The optimum decalcification conditions were as follows:EDTA·Na2concentration 9%(m/V)，decalcifying time 2.5h，pH 8.0.Under the above conditions，the decalcification rate was 99.56%±0.06%.

Penaeus vannamei shrimp head；chitin；preparation technology；response surface methodology

TS254.1

B

1002-0306（2011）10-0273-04

凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）是世界养殖虾产量最高的三大种类之一，中国是凡纳滨对虾的主产国，而广东是我国凡纳滨对虾产量大省，冻凡纳滨对虾产品作为湛江市出口的拳头产品，居湛江水产品出口创汇之首。凡纳滨对虾在加工过程中产生大量的虾头废弃物（仅广东省2006年产生的虾头就达到了6～7万t），引起资源浪费、环境污染等一系列问题。为了解决这些问题，应对虾头废弃物的高值化利用给予足够的重视。凡纳滨对虾虾头甲壳素含量丰富（约为干基含量的17.6%），回收后生产的甲壳素，可广泛应用于食品、日化、生物、农业、水处理、纺织等众多领域。制备甲壳素的主要操作是脱钙和脱蛋白。目前国内生产甲壳素的传统酸碱法即稀碱稀酸二步法存在着明显的弊端：酸碱用量大、成本高、腐蚀性强、污染环境；蛋白质、钙无法回收；操作步骤多、生产周期长。因此，有大量研究者致力于制备甲壳素传统工艺的改良以及生产甲壳素的新方法研究。目前国内外制备甲壳素主要有传统酸碱法、物理法[1]、酶法[2-3]、化学改良法[4-11]、发酵法[12]、微生物合成法等。本研究将脱蛋白最优方法—酶法（自溶法）和脱钙最优方法—螯合法首次进行有机整合，系统研究螯合剂脱钙法的螯合剂选择、各因素对脱钙效果的影响，并在此基础上，利用响应面分析方法优化获得最佳工艺条件，有效解决了传统方法污染环境、耗能量大、生产成本高等问题，操作步骤简单，生产周期短，且在制备甲壳素的同时回收了蛋白质酶解液和EDTA，前者可用于调味料的生产，具有较好的市场前景。

2010-12-08 *通讯联系人

侯佰立（1985-），女，在读硕士，研究方向：水产品深加工。

“十一五”国家科技支撑计划（2007BAD29B09）；农业科技成果转化资金项目（2010GB2E000345）；现代农业产业技术体系建设专项资金。