吴葛洋，曹雁平，王 蓓，王 莹，许 楠

（北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048）

超声场对固定化木瓜蛋白酶的影响研究

吴葛洋，曹雁平*，王 蓓，王 莹，许 楠

（北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048）

用壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶后，超声处理固定化酶能够提高其活力，但对其最适温度与最适pH没有影响。研究了超声温度、超声时间、超声频率及超声强度对固定化酶活力的影响，单因素实验表明，在水浴温度50℃，135kHz，0.45W/cm2条件下超声50min时，酶活力提高最为显著，较未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶活力提高了25.85%。研究低频槽式超声处理的固定化酶的动力学，结果显示超声处理使Km值降低，与未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，接近游离酶的Km值，Vmax值升高了8.35%。结果表明，超声场使酶与底物的亲和力增加。

固定化木瓜蛋白酶，超声，酶活力，米氏方程

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木瓜蛋白酶、福林酚试剂、L-谷胱甘肽 Sigma公司；壳聚糖、海藻酸钠 国药集团化学试剂有限公司；酪蛋白 北京奥博星生物技术有限公司。

多频槽式处理系统JXD-02型 北京金星超声波技术设备有限公司；低温恒温水浴DC-2006 宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外可见分光光度计 岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化酶方法 称取0.4g海藻酸钠溶于20mL 0.1mol/L pH 7.2的Tris-盐酸缓冲液中，再加入0.2g壳聚糖粉末，磁力搅拌加热至溶解并搅拌均匀，冷却至40℃左右，加入0.01g木瓜蛋白酶粉末，搅拌均匀。将此混合液缓慢滴入0.5mol/L氯化钙溶液中形成小球，置于4℃冰箱下30min。

1.2.2 酶活力测定方法 参照福林酚法测定固定化酶活力[9]。

1.2.3 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适条件的影响 28kHz，0.05W/cm2，50℃条件下超声处理固定化木瓜蛋白酶10min，处理后的固定化酶与pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0的10mg/mL酪蛋白在50℃水浴中反应，用方法1.2.2测定酶活力。同条件超声处理的固定化酶与pH为7.0的10mg/mL酪蛋白在40、50、60、70、80℃水浴中反应，用方法1.2.2测定酶活力。未经超声处理的固定化酶在同样条件下测定酶活力作为对照。

1.2.4 超声处理对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 研究超声温度、超声时间、超声频率和超声强度对于固定化木瓜蛋白酶的影响。为研究超声水浴温度对固定化酶活力的影响，采用28kHz，0.05W/cm2超声处理固定化酶10min，水浴温度为30、40、50、60、70、80℃，测定酶活力。为研究超声时间的影响，采用28kHz，0.05W/cm2，50℃水浴条件下处理固定化酶0、10、20、30、40、50、60min，测定酶活力。为研究超声频率的影响，在28、40、50、135kHz，0.05W/cm2，50℃水浴中超声处理固定化酶，测定酶活力。为研究超声强度的影响，135kHz，50℃水浴，超声强度为0.05、0.15、0.25、0.35、0.45W/cm2处理固定化酶，测定酶活力。

1.2.5 超声处理对固定化木瓜蛋白酶动力学的影响经28kHz，0.05W/cm2超声处理10min的固定化木瓜蛋白酶，分别与浓度为1、5、10、15、20mg/mL的酪蛋白进行反应，用产物酪氨酸的浓度表示反应速率V，单位为U/g·min。使用Lineweaver-Burk plot双倒数作图法计算Km和Vmax值。

2 结果与讨论

2.1 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适条件的影响

图1 固定化木瓜蛋白酶的最适pH

最适pH是酶的特性之一，过酸或过碱会导致酶的相关基团的结合和解离，酶分子的空间结构发生改变，从而丧失活性。对壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的最适pH进行测定，结果如图1所示。从图中可以看出，pH为6.5时未经超声处理的固定化酶活力为92736U/g，随着pH升高，酶活力在pH7.0处达到最高值，为102984U/g。当pH继续升高，酶活力则有所下降，pH7.5和pH8.0时酶活力为85699、79219U/g。因此固定化木瓜蛋白酶的最适pH在7.0附近。超声处理没有改变最适pH的水平和范围。超声处理后的固定化酶在pH6.5、7.0、7.5、8.0时酶活力为96628、108346、90790、81956U/g，均较对应pH下的非超声处理酶活力有所提高。值得指出的是，测定固定化木瓜蛋白酶在pH6.0条件下的酶活力时，壳聚糖-海藻酸钠凝胶发生溶解，固定化酶小球变得不再完整。

温度对酶促反应具有两方面影响：温度升高促进酶与底物分子的运动，从而提高碰撞几率，使酶促反应更容易发生；但是，温度升高到一定程度时，蛋白质分子会发生变性，从而改变了活性中心的结构，阻碍酶促反应的效率。经实验测定，游离木瓜蛋白酶的最适温度50℃。对壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的最适温度的测定结果如图2所示。在pH7.0条件下，未经超声的固定化酶与底物酪蛋白反应温度为40、50、60、70、80℃时的酶活力分别为101668、106139、109293、118552、109816U/g，而经过28kHz，0.05W/cm2超声处理10min后，相应反应温度下的酶活力分别为107884、111617、115323、122537、115071U/g，固定化后木瓜蛋白酶的最适温度上升到70℃。经过固定化处理后，酶分子受到载体凝胶的影响，对高温的抵抗增强，所以在较高的温度下显示出较强活力。

图2 固定化木瓜蛋白酶的最适温度

2.2 超声处理对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

图3 超声温度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

2.2.1 超声温度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响控制超声温度为30～80℃，28kHz、0.05W/cm2超声处理10min后测定固定化木瓜蛋白酶活力。实验结果如图3，经过30、40、50℃超声处理的固定化木瓜蛋白酶活力较未超声处理的酶活力提高，相对酶活力分别为102.58%、105.57%和108.60%，其中在50℃水浴进行超声处理的效果最佳，酶活力为117921U/g。随着超声温度继续升高，当超声温度高于60℃，超声处理后的固定化酶活力较未超声处理的酶活力降低，其中60、70、80℃的相对酶活力分别为77.01%、66.73%和63.59%。从实验结果可以看出，与低温区相比，在高温区处理固定化木瓜蛋白酶，酶活力对于温度变化更为敏感。

2.2.2 超声时间对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 超声时间是影响超声效果的另一个重要因素，时间过长会破坏固定化酶的外部形态，导致酶游离出来而降低了固定化酶的质量和使用次数；超声时间过短，则超声场的空化效应、热效应和机械效应等无法对固定化酶起到预期的作用。在28kHz，0.05W/cm2超声条件下测定超声时间对于固定化木瓜蛋白酶活力的影响。从图4可以看出，超声处理0～50min内，随着超声时间的延长，超声处理的固定化酶相对酶活力有所增加，超声时间为50min时酶活力相对于非超声的固定化酶活力提高最显著，酶活力提高了21.2%，如果继续延长超声时间，相对酶活力则开始下降。故而最佳的超声时间应为50min。

图4 超声时间对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

2.2.3 超声频率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 不同频率的超声对固定化木瓜蛋白酶进行处理，结果如图5所示。随着频率增大，相对酶活力有上升的趋势。经过28、40、50、135kHz超声场处理，固定化酶的酶活力较非超声时的酶活力分别提高了11.11%、12.35%、15.45%和22.69%。135kHz超声处理后固定化木瓜蛋白酶活力的提高比率显著高于其他频率超声处理的效果。

图5 超声频率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

2.2.4 超声强度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 使用135kHz的超声波在不同的超声强度下处理固定化酶，如图6所示。随着超声强度增加，超声处理对酶活力的提高越为显著。0.45W/cm2超声场处理后，固定化木瓜蛋白酶活力为127906U/g，与未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶活力提高了25.21%。

图6 超声强度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

2.3 超声处理对固定化木瓜蛋白酶动力学的影响

对游离木瓜蛋白酶、固定化木瓜蛋白酶以及超声处理后的木瓜蛋白酶的动力学值进行测定，用lineweaver-Burk双倒数作图法计算Km和Vmax值，结果如表2显示，固定化酶的Km值为2.7624mg/mL，较游离木瓜蛋白酶的Km值1.8528mg/mL提高了49.09%。但是经过28kHz、0.05W/cm2超声处理后Km值降低为1.8835mg/mL，与未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，甚至接近游离酶的Km值。木瓜蛋白酶经壳聚糖-海藻酸钠固定化后，Vmax值从游离酶的23.3645g/U降至16.0514g/U，经超声处理后，固定化木瓜蛋白酶的Vmax有所升高，为17.3913g/U，升高了8.35%。米氏常数Km表示酶对于底物分子亲和力的大小，Km越小，酶对底物的亲和力就越大，酶分子与底物分子的有效碰撞次数也越大[10]。对木瓜蛋白酶酶学动力学的研究结果表明，超声处理增加了固定化酶对底物酪蛋白的亲和力，增加分子间的有效碰撞几率，从而增加了酶与底物的亲和力，使酶促反应更容易发生。超声波具有空化效应、热效应和机械效应，会对壳聚糖-海藻酸钠凝胶的结构产生影响，改善内部通道，促进扩散作用，从而使固定化酶的活性增高。机械效应形成的湍流和微扰可能对固定化酶的结构发生改变，使其活性中心更容易暴露，与底物分子接触。

图7 木瓜蛋白酶催化反应的双倒数曲线

表1 木瓜蛋白酶的米氏方程

表2 木瓜蛋白酶催化反应的Vmax和Km

3 结论

3.1 壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的最适温度为70℃，最适pH为7.0，超声处理使固定化木瓜蛋白酶活力提升，但对其最适温度和pH均没有影响。

3.2 超声频率、超声功率、超声温度以及超声时间条件均会对超声处理后的固定化酶活力产生影响。单因素实验表明，经50℃，135kHz，0.45W/cm2条件下超声处理50min，固定化木瓜蛋白酶酶活力提高最为显著，较未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶活力提升25.85%。马海乐等[11]研究了变幅杆式超声对碱性蛋白酶活力的影响，20kHz、80W变幅杆式超声处理碱性蛋白酶4min，酶活力提升了5.80%。与变幅杆式超声相比，槽式超声使用循环水浴保持恒定温度，避免了热效应的过度影响。

3.3 经过超声处理后，固定化木瓜蛋白酶的Km值明显降低，与未经超声处理的固定化木瓜蛋白酶Km值相比下降了31.83%，接近游离酶的Km值，超声场使酶与底物的亲和力增加。超声场强化酶促反应的原因分为两个方面：其一，超声场可能改变壳聚糖-海藻酸钠凝胶的结构，增加内部的通道，有利于扩散，从而使底物与酶更加充分接触，提高固定化酶的活力，在进一步研究中，可以借助电镜等手段对比证明超声处理前后壳聚糖-海藻酸钠凝胶的结构变化；其二，超声场的作用可能改变酶的结构，使活性位点更容易暴露。陈小丽等[12]研究了超声处理前后游离木瓜蛋白酶的结构变化，结论显示超声处理后酶的紫外吸收光谱和荧光发射光谱未发生改变，而差示光谱出现明显的正峰和负峰，证明木瓜蛋白酶的构型没有改变，但是构象发生了变化。与游离酶相比，检测固定化酶结构的研究在国内鲜见文献报道，目前仍是一个研究难点。

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Effect of ultrasonic treatment on immobilized papain

WU Ge-yang,CAO Yan-ping*,WANG Bei,WANG Ying,XU Nan
（School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China）

Chitosan-sodium alginate immobilized papain activity was enhanced by ultrasonic treatment，while the optimal temperature and the optimal pH were not influenced by the treatment.Effect of ultrasonic temperature， ultrasonic treating time，ultrasonic frequency and power on immobilized papain activity was studied.Result of single-factor experiment showed that treating the immobilized papain by 50℃，135kHz，0.45W/cm2ultrasonic for 50min could increase the papain activity most.Immobilized papain activity was enhanced by 25.85%in comparison to the untreated immobilized papain activity.Research on enzyme kinetics of free papain and immobilized papain showed that Km decreased by 31.83%after immobilized papain treated by ultrasonic.Vmax raised 8.35%of the untreated immobilized papain.This result provided the evidence that ultrasonic treatment could raise the affinity of enzyme and substrate.

immobilized papain；ultrasonic；enzyme activity；Michealis-Menten equation

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）10-0142-04

半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶和一些相关的植物蛋白酶类，如木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶等[1]。木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）的活性位点由Cys25-His159-Asn175组成[2]，能催化水解蛋白质的肽键和酰胺键[3]，在食品、染料和纺织等工业生产中应用广泛[4]。游离木瓜蛋白酶在高温等条件下结构受到破坏，酶在水溶液中也容易失去活力，催化效果受到影响。固定化酶技术可将酶分子以物理或化学方法固定在一定的载体上，使其定向发生酶促反应，反应结束后，酶可以回收并重复使用[5]。固定化酶较游离酶稳定性高，可重复利用，能够实现连续化、自动化生产[6]。超声波的空化效应、热效应和机械效应能够增强传质效果，改变大分子结构，故而对提取、分离、水解等化学反应具有促进作用[7]。文献报道表明，利用低频超声场处理酶，会对其结构产生影响，使其活性位点更容易与底物分子接触，从而增加反应几率，提高酶活力[8]。本文研究低频槽式超声场对固定化木瓜蛋白酶活力的影响，并且从酶学动力学方面探讨其影响机理，为进一步阐述和研究超声场对固定化酶影响的机理提供基础。

2011-07-25 *通讯联系人

吴葛洋（1987-），女，研究生，研究方向：食品生物技术。