朱 林 敏, 朱 文 佳, 周 锋 伟, 刘 丽 双, 付 绍 平, 朱 靖 博

(大连工业大学 植物资源化学与应用研究所, 辽宁 大连 116034)

0 引 言

紫杉醇是从太平洋短叶红豆杉树皮中分离到的一种具有抗癌活性的四环二萜化合物[1]。紫杉醇以其独特的抗癌机理得到广泛的应用,目前已作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的临床一线用药[2]。迄今,紫杉醇主要从红豆杉属植物的茎皮中分离获得,但树皮中紫杉醇的含量仅有0.01%左右[3],因此研究高选择性和稳定性好的吸附材料用于紫杉醇的富集分离具有十分重要的意义。分子印迹技术是模仿天然抗原-抗体反应原理,制备对某一特定分子(模板分子)具有分子识别性能的分子印迹聚合物的技术[4]。分子印迹聚合物兼备了生物识别体系和化学识别体系的优点,具有选择性高、制备简单、稳定性好、机械强度高、对环境耐受性好等特点[5],可选择性识别富集复杂样品中的目标物。因此,MIP被广泛应用于天然产物活性成分的分离和富集[4,6],但有关紫杉醇分子印迹聚合物的制备及其吸附特性的研究目前尚未见报道。本研究以紫杉醇为模板分子,在优化了功能单体和溶剂的基础上,制备了对紫杉醇具有高特异性吸附的印迹聚合物,为从植物中富集、分离微量紫杉醇提供了一种新材料。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

UV-2102 PC型紫外可见分光光度计,HY-4型调速多用振荡器,UltiMate3000高效液相色谱仪。

紫杉醇,上海天伟生物制药有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯,EGDMA,日本TCI公司；偶氮二异丁腈,AIBN,分析纯,天津光复精细化工研究所,使用前用乙醇重结晶纯化；丙烯酰胺,AM,Amresco公司；α-甲基丙烯酸,MAA,分析纯,成都市科龙化工试剂厂,使用前用减压蒸馏除去阻聚剂；2-乙烯基吡啶,2-VP,Sigma-Aldrich公司；4-乙烯基吡啶,4-VP,Sigma-Aldrich公司。所用其他试剂均为分析纯,色谱分析所用试剂均为色谱纯。

1.2 紫外光谱分析

选取MAA、AM、2-VP、4-VP 4种功能单体,固定紫杉醇的浓度为0.05 mmol/L,分别加入不同量的功能单体溶液,置于振荡器振荡30 min,冰箱中过夜,以相应浓度的功能单体溶液作参比,在200～300 nm扫描紫杉醇-功能单体溶液的紫外吸收光谱。

选取乙腈、氯仿、四氢呋喃3种溶剂,固定紫杉醇乙腈(或氯仿、四氢呋喃)的浓度为0.05 mmol/L,分别加入不同量的2-VP乙腈(或氯仿、四氢呋喃)溶液,置于振荡器振荡30 min,冰箱中过夜,以相应浓度的2-VP溶液作参比,在200～300 nm扫描紫杉醇-功能单体溶液的紫外吸收光谱。

1.3 紫杉醇分子印迹聚合物的制备

称取0.1 mmol紫杉醇,溶于5 mL氯仿中,加入2-VP 0.6 mmol,在振荡器中振荡6 h,使紫杉醇与2-VP充分作用,而后加入3.0 mmol EGDMA,10 mg AIBN,充分混合后转入50 mL磨口锥形瓶中,通氮气10 min,密封,置60 ℃油浴中反应24 h,得到块状固体。将固体研磨过75 μm筛后,用甲醇/乙酸(体积比为9∶1)混合溶液索氏提取24 h,除去模板分子后,再用甲醇洗至中性。用丙酮反复沉降,除去过细粒子。晾干后60 ℃真空干燥至恒重,得到紫杉醇印迹聚合物(MIP)。

空白聚合物(non-imprinted polymer,N-MIP)的制备除不加模板分子外,其余与上述制备方法相同。

1.4 聚合物对模板分子紫杉醇的平衡结合实验

准确称取一组等量MIP和N-MIP 10 mg,分别置于1.5 mL的离心管中,加入0.10～0.40 mmol/L的紫杉醇-氯仿溶液1 mL,于室温下振荡18 h。用0.22 μm的滤膜过滤后,将滤液中的氯仿挥干,加入1 mL甲醇,用HPLC检测,并计算出吸附平衡时溶液中紫杉醇的浓度,根据结合前后溶液中紫杉醇浓度变化计算出聚合物对紫杉醇的结合量Q(μmol/g)。

1.5 高效液相色谱分析

色谱柱Hypersil ODS2柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm,大连依利特分析仪器有限公司)；流动相:体积比为50∶50的乙腈-0.1%甲酸水；体积流量1 mL/min；进样量20 μL；检测波长229 nm。

2 结果与讨论

2.1 功能单体的选择

模板分子和功能单体在聚合前能否通过分子间相互作用形成稳定的主客体复合物,是获得高亲和性和选择性印迹聚合物的关键[7]。因此,选择合适的功能单体对制备高识别性能的分子印迹聚合物是非常重要的。传统选择功能单体的方法是先合成印迹聚合物,然后评价功能单体对聚合物的影响,但这种方法耗时且耗费大量的材料。为快速、合理地评价在预聚合过程中模板分子和功能单体间的相互作用,本文采用紫外分光光度法对其进行了研究。

从紫杉醇与不同功能单体作用的一系列紫外吸收光谱图(图1)可以看出:随着功能单体浓度的增大,紫杉醇的波峰强度逐渐降低,说明紫杉醇和4种功能单体均有作用力。加入功能单体后,模板分子的紫外吸收值越小,表明模板分子与功能单体的相互作用越强。比较图1谱图发现,4种功能单体中,2-VP与模板分子紫杉醇之间的作用力最强,是一种较理想的功能单体。从图1(c)中可以看出,模板分子与功能单体的比例超过1∶6时,再增加功能单体的用量,吸收峰的强度变化明显较弱。由此说明,适当增加功能单体的用量可使模板分子与功能单体的作用更充分,但并不是功能单体的用量越多越好,因为过量的功能单体可能导致非组装的功能单体的残基产生,从而非选择性结合位点增加；也可能引起单体自身的缔合,从而导致选择性结合位点降低。综合考虑各因素,本实验选择了模板分子紫杉醇与功能单体2-VP的摩尔比为1∶6来制备印迹聚合物。

Line (a) was obtained against pure solvent,and line (b)～(f) were obtained corresponding functional monomer solution as blanks. The concentration of taxol is 0.05 mmol/L,and the concentrations of functional monomer from lines (a) to (f) are 0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L,respectively.

图1 不同功能单体存在下紫杉醇的紫外吸收光谱图

Fig.1 UV absorption spectra of taxol in the presence of different functional monomers

2.2 紫杉醇与2-VP在不同溶剂中的相互作用

溶剂是合成聚合物的关键因素之一。在聚合过程中,一方面要求溶剂能够溶解模板分子和功能单体等物质,另一方面要求溶剂与模板分子之间的相互作用力较小,不至于影响模板分子与功能单体之间形成主客体复合物的稳定性[8]。本实验研究了在乙腈、氯仿和四氢呋喃3种溶剂中紫杉醇和2-VP的相互作用。固定紫杉醇的浓度为0.05 mmol/L,加入不同量的2-VP后得到的紫外光谱均显示:当逐渐增加体系中2-VP的浓度时,紫杉醇在乙腈、氯仿和四氢呋喃中吸收峰的吸光度呈下降趋势,表明紫杉醇和2-VP在不同溶剂中均形成了配合物。紫杉醇(T)和2-VP(M)之间形成配合物可以表示为

(1)

由于反应中2-VP的浓度b0远大于紫杉醇的浓度a0,参照文献[9],紫杉醇与2-VP的结合反应公式可推导和整理如下表达式:

(2)

2.3 聚合物的吸附特性及Scatchard分析

在紫杉醇的浓度为0.10～0.40 mmol/L时,聚合物对紫杉醇的吸附等温曲线如图2所示。在所考察的浓度范围内,MIP和N-MIP对紫杉醇均有吸附；开始时随着紫杉醇浓度的增大,MIP和N-MIP结合量都快速增加,当浓度达到0.3 mmol/L时结合量均达到最大值,之后聚合物的吸附趋于饱和,且MIP对紫杉醇的结合量明显高于N-MIP。表明两种聚合物的空间结构存在差异,印迹过程中模板分子在MIP中留下的与之空间结构上匹配的具有多重作用点的三维空穴,这种空穴对模板分子具有高亲和性和特异识别性,所以MIP对紫杉醇的结合量大；而在N-MIP中功能基团分布是任意的,没有形成与模板分子在空间结构上互补的分子识别位点,对模板分子没有特异选择性,对紫杉醇的吸附主要是非特异性吸附,其吸附能力较弱,因而N-MIP对紫杉醇的结合量小。

表1 紫杉醇与2-VP在不同溶剂中的结合常数及摩尔比

图2 紫杉醇在聚合物上的吸附等温曲线

分子印迹研究中常用Scatchard模型来评价印迹聚合物的结合特性[4,9],Scatchard方程为

Q/c=(Qmax-Q)/KD

(3)

式中,KD为结合位点的平衡离解常数；Qmax为聚合物对紫杉醇的最大表观结合量；c为平衡时溶液中紫杉醇的浓度；Q为平衡时聚合物对紫杉醇的结合量。以Q/c对Q作图得到一条直线,如图3所示。

图3 MIP的Scatchard曲线

说明在所研究的浓度范围内,MIP中存在一类等价的结合位点,它对紫杉醇呈现均匀的亲和力。从图3中直线的斜率和截距分别可以计算出KD=29.89 mg/L,Qmax=5.66 mg/g。

3 结 论

以紫杉醇为模板分子,采用本体聚合法首次合成了紫杉醇分子印迹聚合物。实验结果表明,该印迹聚合物对模板分子具有高的结合量且结合特异性强。可将其用于固相萃取及色谱固定相,为紫杉醇的分离纯化提供一种新的选择性富集材料。

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