石开仪，许 宁，陶秀祥，洪芬芬

(1.中国矿业大学煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室 ，江苏徐州 221008;2.中国矿业大学化工学院，江苏徐州221008;3.宿州学院化学与生命科学院，安徽宿州 234000)

·开发与研究·

白腐真菌Hyprocrea lixii AH的产酶特性研究

石开仪1，2，许 宁3，陶秀祥1，2，洪芬芬1，2

(1.中国矿业大学煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室 ，江苏徐州 221008;2.中国矿业大学化工学院，江苏徐州221008;3.宿州学院化学与生命科学院，安徽宿州 234000)

为了确定白腐真菌(H.lixii AH)在SMA培养基中的最佳产酶条件，利用正交试验研究了藜芦醇、Cu2+以及表面活性剂(吐温)的用量对真菌H.lixii AH生长和产酶的影响。发现吐温80和低浓度Cu2+对真菌的生长有促进作用，过氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影响最大，优选浓度均是0.2g/L。LiP、MnP和Lac受吐温的影响较显著，添加吐温60后，LiP和MnP活性分别提高了11.7%和38%，而Lac有所下降。

白腐真菌;哈茨木霉;产酶;活性;正交试验

Abstract:In ordor to determine the optimum enzyme production condition of white rot fungus hyprocrea lixii AH in SMA medium，the effect of the amount of veratryl alcohol，Cu2+and surfactunt to H.lixii AH growthing and its enzyme production are studied by orthogonal experiment.The result shows，the tween 80and lower concentration Cu2+has promoting effect to fungus growthing，the effect of Cu2+to peroxidase and polyphenol oxidase are maximum，the optimal selecting concentration of Cu2+all is 0.2g/L.The effect of tween to LiP，MnP and Lac is significant，after adding tween 80，the activity of LiP and MnP improve respectively 11.7%and 38% ，but the activity of Lac decreases somewhat.

Key words:white rot fungus;enzyme production;activity;orthogonal experiment;hamington baraki enayme

白腐真菌因其具有降解各种不同结构的天然及合成化学物质的能力，因而吸引国内外学者的关注［1］。白腐真菌在环境保护中，如造纸废水处理［2］、土壤污染治理、重金属污染治理［3］等方面，均得到很好的应用。白腐真菌对大分子化合物的降解主要是酶起作用［4－5］，其中木质素降解酶系［6］起着关键性作用。本文主要研究本实验室筛选的一株具有煤炭降解能力的白腐真菌的产酶特性，主要研究了酶激活剂(黎芦醇、Cu2+)和表面活性剂(吐温)对产酶的影响。

1 实验材料与方法

1.1 菌种与培养基

采用实验室筛选并保存的白腐真菌，命名为真菌Hyprocrea.lixii AH，通过16s rDNA测定属于哈茨木霉。实验中采用SMA培养基，其组成为:麦芽糖40g，蛋白胨 10g，琼脂 20g，水 1000mL，自然pH值。

1.2 正交试验设计

为提高真菌酶活性，考察了藜芦醇、Cu2+以及表面活性剂对真菌H.lixii AH产酶和煤炭降解的影响。正交试验因素、水平如表1所示。

表1 产酶正交试验因素水平表

采用3因素3水平正交表。试验中用两组平行样，分别标号 1、2、3、4、5、6、7、8、9。试验从接种开始每隔一定时间分别测量各组的菌落大小以判断各组生长情况，再过1～2d开始测酶活。

1.3 酶活性的测定

过氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定按照文献进行，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的活性按照文献中的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 添加剂对真菌生长的影响

首先考察了不同浓度的藜芦醇和铜离子以及不同表面活性剂对真菌生长和产酶的影响。由菌丝生长图(图1)可知，3号生长最快，4号和8号生长最慢。与图2未优化前的菌体生长比较可以看出，3号和6号比未优化前生长要快。3号和6号都加入的是吐温80，9号同样加吐温80，也生长比较快。由此可推测，吐温80可以促进真菌H.lixii AH生长。生长较慢的几组试验的Cu2+浓度都较大，可能当Cu2+浓度大于0.2g/L时，菌体生长受到抑制。

图1 优化培养基中真菌H.lixii AH的生长

图2 未优化培养基中菌丝生长速度

2.2 酶活性的变化

根据正交试验表1进行试验，测定各酶活性，结果如表2所示。

表2 SMA优化培养基中的酶活性 U

2.2.1 以过氧化物酶为指标的正交试验分析

以过氧化物酶的活性为指标的分析表如表3和表4所列。

表3 以过氧化物酶为指标的直观分析表

表4 以过氧化物酶为指标的方差分析表

由表4可以看出，Cu2+对真菌H.lixii AH的过氧化物酶活性的影响最为显著，吐温的影响较显著，藜芦醇影响最小。直观分析(表3)表明，A因素(藜芦醇)以第一水平、B因素(吐温)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即当藜芦醇为1mmol/L，吐温20，Cu2+浓度为0.2g/L 时，SMA 培养基的过氧化物酶的活性最大，达1377U，比未添加试剂的688.5U的提高了一倍。

2.2.2 以多酚氧化酶为指标的正交试验分析

以多酚氧化酶为指标的正交分析表如表5和表6所示。由表6可以看出，H.lixii AH的多酚氧化酶活性也是受Cu2+的影响最为显著，而藜芦醇和吐温的影响都一般。直观分析(表5)表明，A因素(藜芦醇)以第二水平、B因素(吐温)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即当藜芦醇为3mmol/L，吐温20，Cu2+用量为0.2g/L 时，SMA 培养基中的多酚氧化酶活最大，为324U，然而却比未添加上述试剂的364.5U有所降低。2.2.3 以LiP为指标的正交试验分析

表5 以多酚氧化酶为指标的直观分析表

表6 以多酚氧化酶为指标的方差分析表

以LiP为指标的正交试验分析如表7和表8所示。

表7 以LiP为指标的直观分析表

表8 以多酚氧化酶为指标的方差分析表

由表8可知，藜芦醇的浓度H.lixii AH分泌的LiP活性的影响最为显著，吐温次之，Cu2+浓度影响最小。由表7的直观分析表明，藜芦醇浓度以第三水平、吐温以第二水平、Cu2+浓度以第一水平或第三水平最好。即当藜芦醇为5mmol/L，吐温60，Cu2+用量为0.2g/L或0.08g/L时即低浓度时，SMA培养基中H.lixii AH的LiP酶活最大，其活力为11.79U，比未添加上述试剂的10.556U提高了11.7%。

2.2.4 以MnP为指标的正交试验分析

以MnP为指标的正交试验分析如表9和10所示。由表10可发现，吐温对H.lixii AH的MnP活性的影响最为显著，藜芦醇和Cu2+的影响一般。表9的直观分析表明，A因素以第二水平、B因素以第二水平、C因素以第三水平最好。即当藜芦醇浓度为 3mmol/L，吐温 60，Cu2+浓度为 0.08g/L 时，SMA培养基中H.lixii AH的MnP活性最大，为6.728U，比未添加试剂的4.875U提高了38.4%。

表9 以MnP为指标的正交试验直观分析表

表10 以MnP为指标的正交试验方差分析表

2.2.5 以漆酶为指标的正交试验分析

以漆酶为指标的正交试验分析见表11和12。

表11 以漆酶为指标的直观分析表

表12 以漆酶为指标的方差分析表

由表12可知，吐温对H.lixii AH分泌的漆酶活性的影响最显著，藜芦醇和Cu2+浓度的影响一般。表11的直观分析表明，藜芦醇以第一水平、吐温以第二水平、Cu2+以第二水平最好。即当藜芦醇浓度为 1mmol/L，吐温 60，Cu2+浓度 0.5g/L时，SMA培养基中H.lixii AH的漆酶酶活性最大，为15.83U，但是比未添加上述试剂的21.25U有所降低。

3 结果与讨论

利用正交试验考察了Cu2+浓度、黎芦醇浓度和吐温在SMA培养基中对真菌H.lixii AH的上述各种酶活性的影响，结果发现不同胞外酶受到以上条件影响情况有所差异。过氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影响最大，优选浓度均是0.2g/L。其中，过氧化物酶受到激活，多酚氧化酶稍受抑制。LiP、MnP和Lac受吐温的影响较显著，选用吐温60。添加吐温60后，LiP活性提高了11.7%，MnP活性提高了38%，然而Lac的酶活性略有下降。高浓度黎芦醇促进LiP的分泌，而对其他胞外酶的活性有抑制作用。

［1］ Akin D E，Morrison W H，Rigsby L L，et al.Biological delignification of plant components by the white rot fungi ceriporiopsis subvermispora and cyathus stercoreus［J］.Ani malFeed Science and Technology，1996，63(1－4):305－321.

［2］ 赵志法.白腐真菌降解苯胺废水试验研究［J］.中国农村水利水电，2010，(9):36－38.

［3］ 吴 涓，李清彪.黄孢原毛平革菌吸附铅离子机理的研究［J］.环境科学学报，2001，21(3):291－295.

［4］ Mester T，Field J A.Optimization of manganese peroxidase production by the white rot fungus Bjerkandera sp.strain BOS55［J］.FEMS Microbiology Letters，1997，155(2):161－168.

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［6］ 李慧蓉.白腐真菌生物学和生物技术［M］.北京:化学工业出版社，2005.

［7］ 杜 莹，陶秀祥，石开仪，等.几种降解褐煤模型化合物的白腐真菌性质研究［J］.洁净煤技术，2009，15(4):33－38.

Study on Characteristic of Enzyme Production of White－rot Fungus Hyprocrea Lixii AH

SHI Kai－ yi，2，XU Ning，TAO Xiu － xiang，2，HONG Fen － fen，2
(1.State Key Laboratory of Coal Conversion，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;2.School of Chemical and Engineer，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;3.School of Chemical and Life Sciences，Suzhou University，Suzhou 234000，China)

TQ426.97

A

1003－3467(2011)05－0029－041311

2011－03－01

国家自然科学基金资助(50374068);国家自然科学基金委员会创新研究群体科学基金资助项目(50921002);中国矿业大学科技基金资助(E200407);宿州学院硕士科研启动基金资助项目(2009YSS11)。

石开仪(1983－)，男，在读博士，从事煤炭生物液化方面的研究，电话:15094356744;陶秀祥，教授，电话:(0516)83591057。