王 怡，牛子长，何 斌，解小刚，刘 剑，王未沫

心血管疾病是一种严重危害人类健康的疾病，全球每年近2 000万人死于急性心血管事件。易损斑块是急性心血管事件发生的重要物质基础，而稳定斑块、预防斑块破裂已成为防治急性心血管事件的重要目标［1，2］。麝香通心滴丸是依据芳香温通法由古方“至宝丹”化裁而来，主要由麝香、人参茎叶总皂苷、蟾酥、人工牛黄、丹参、熊胆、冰片等药物组成，具有芳香开窍、益气温阳、理气止痛之功效，以上诸药寒温并用，以温为主；通补兼施，以补为辅，既具芳香温通之性，药力又平稳和缓。本研究在药效学实验的基础上从脂质代谢、氧化应激、炎症反应、基质代谢和凋亡等角度，探讨麝香通心滴丸稳定家兔易损斑块的作用机制，为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料 日本大耳白家兔91只，雄性，体重1.8kg～2.2kg，购自北大医学部动物实验中心。合格证号：SCXK（京）2005－0002。饲养于天津中医药大学实验动物中心，符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境设施标准》二级标准。适应性饲养1周以上备用。高脂饲料配方，普通饲料89%（天津市武清区科达养殖中心）、1%胆固醇、大豆色拉油10%。

1.2 药物 麝香通心滴丸干粉，黄褐色粉末状，内蒙古伊泰药业有限责任公司提供，批号20061120。辛伐他汀，杭州默沙东药厂生产，批号070112。

1.3 试剂及仪器 总胆固醇（TC）、中国斑点蝰蛇毒；组胺、αactin单克隆抗体；CD68单克隆抗体（美国Thermo）；TC、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）试剂盒（中生北控，批号070371）；基质金属蛋白酶－（MMP2）、（TIMP2）、单核细胞趋化因子（MCP－1）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、ox－LDL以及血管黏附分子－1（VCAM－1）ELISA 试剂盒，购自美国RB公司；髓质过氧化物酶（MPO），南京建成，批号20080423；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成，批号070603）；TRIZOL总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）；TUNEL细胞凋亡试剂盒（美国Millipore）。

日本Olympus公司正置显微镜及成像系统、美国Image－Pro Plus Version 6.0图像分析系统；半自动生化分析仪（Micro95、荷兰威图）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及给药 家兔根据血脂随机分为正常对照组（11只，每天给予普通饲料200g）及造模组（80只，每天给予高脂饲料50g，再饲以普通饲料150g）。造模组复制高脂饮食伴主动脉球囊拉伤术致动脉粥样硬化易损斑块模型，模型复制8周后根据血脂将其随机分为5组：模型组，麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg和0.5mg／kg组，阳性对照组（辛伐他汀2mg／kg）。各组分别给予相应药物，连续灌胃给药12周。

1.4.2 动物模型建立 家兔高脂饮食（每天给予高脂饲料50 g，再饲以普通饲料150g）8周，并于高脂饲养两周后行主动脉球囊拉伤术。

1.4.3 药物触发 给药第12周末，参照文献方法［3，4］对家兔进行药物触发，中国斑点蝰蛇毒0.15mg／kg腹膜下注射，30min后耳缘静脉注射组胺0.02mg／kg，于处死动物前24h、48h给予两次药物触发。

2 结 果

2.1 麝香通心滴丸对动脉粥样硬化（AS）家兔血清血脂水平的影响 与正常对照组比较，AS家兔血清TC、TG、LDL、TC／HDL均明显升高，其中以TC升高显著；麝香通心滴丸各剂量组有不同程度降低血脂水平的作用，其中以降低TC／HDL比值的作用显著（P＜0.05），辛伐他汀组能够显著降低家兔血脂水平（P＜0.05）。详见表1。

表1 麝香通心滴丸对AS家兔血清血脂水平的影响（±s）

表1 麝香通心滴丸对AS家兔血清血脂水平的影响（±s）

组别 剂量 n TC mmol／L TG mmol／L HDL mmol／L LDL mmol／L TC／HDL正常对照组 － 11 1.44±0.52 0.70±0.18 0.35±0.16 0.29±0.114.00±1.49模型组 － 12 13.58±7.051） 1.33±0.821） 2.05±0.601） 4.37±2.291） 5.94±1.491）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 9 10.59±3.52 0.60±0.15 2.23±0.40 3.30±1.19 4.67±0.812）麝香通心滴丸组 1mg／kg 11 9.21±5.14 0.64±0.22 1.65±0.70 3.56±2.24 5.30±0.89麝香通心滴丸组 2mg／kg 11 9.99±4.85 0.62±0.20 1.88±0.51 3.42±1.46 5.12±1.44辛伐他汀组 2mg／kg 9 7.39±5.872） 0.48±0.132） 1.30±0.542） 2.51±2.282） 4.23±1.972）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

2.2 麝香通心滴丸对AS家兔氧化应激水平的影响 家兔形成AS后SOD活性明显降低（P＜0.01），而 MPO、MDA、ox－LDL则明显升高（P＜0.01）；给予麝香通心滴丸干预后，血清SOD明显升高，其中以高、中剂量组为优（P＜0.05）；降低MPO、MDA、ox－LDL的血清含量（P＜0.05）。详见表2。

表2 麝香通心滴丸对AS家兔血清SOD活性等指标的影响（±s）

表2 麝香通心滴丸对AS家兔血清SOD活性等指标的影响（±s）

组别 剂量 n SOD（U／mL） MDA（nmol／mL） MPO（U／L） ox－LDL（μg／L）正常对照组 － 11 218.08±35.89 1.76±0.51 66.18±9.1364.48±9.73模型组 － 12 140.31±39.531） 5.53±2.421） 97.27±27.931） 279.85±28.031）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 9 138.25±43.26 4.02±1.302） 70.11±22.572） 193.96±23.512）麝香通心滴丸组 1mg／kg 11 206.47±31.812） 3.05±0.952） 68.67±13.552） 208.36±15.662）麝香通心滴丸组 2mg／kg 11 184.17±33.732） 4.21±1.482） 62.93±28.212） 201.81±14.592）辛伐他汀组 2mg／kg 9 179.47±14.022） 3.00±0.932） 70.43±29.262） 176.80±14.762）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

2.3 麝香通心滴丸对AS家兔血清 MMP2、TIMP2含量和活性的影响 模型组血清 MMP2含量及MMP2／TIMP2较正常组明显升高（P＜0.01）。麝香通心滴丸2mg／kg组可以明显降低AS家兔血清MMP2含量；麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg组可以明显升高TIMP2含量，降低MMP2／TIMP2（P＜0.05）。详见表3。

表3 麝香通心滴丸对AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影响（±s）

表3 麝香通心滴丸对AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影响（±s）

组别 剂量 n MMP2（ng／mL） TIMP2（ng／mL） MMP2／TIMP2正常对照组 － 11 927.25±124.26 439.60±48.76 2.04±0.27模型组 － 12 1 160.62±205.971） 449.47±60.74 2.48±0.251）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 8 1 113.21±165.05 482.43±56.65 2.21±0.222）麝香通心滴丸组 1mg／kg 11 1 050.99±125.06 517.84±58.612） 2.00±0.192）麝香通心滴丸组 2mg／kg 11 1 026.49±132.962） 504.87±78.822） 2.05±0.292）辛伐他汀组 2mg／kg 9 982.98±107.612） 484.16±32.04 1.98±0.182）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

2.4 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉MMP2和TIMP2mRNA表达的影响（见表4）

表4 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉MMP－2、TIMP－2表达的影响（±s） ng／mL

表4 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉MMP－2、TIMP－2表达的影响（±s） ng／mL

组别 剂量（mg／kg） n MMP－2 TIMP－2正常对照组 －10 1.07±0.37 1.00±0.28模型组 － 12 2.84±0.661） 1.79±0.841）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 9 2.34±1.21 2.34±0.89麝香通心滴丸组 1mg／kg 12 1.94±1.202） 2.85±0.831）麝香通心滴丸组 2mg／kg 10 2.63±1.07 2.33±0.87辛伐他汀组 2mg／kg 8 1.78±1.112） 2.62±1.032）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

2.5 麝香通心滴丸对AS家兔凋亡细胞密度的影响 （见表5）

表5 麝香通心滴丸对AS家兔凋亡细胞密度的影响（±s）

表5 麝香通心滴丸对AS家兔凋亡细胞密度的影响（±s）

组别 剂量 n 凋亡细胞密度（／mm2）正常对照组 － 10 110.60±29.14模型组 0.5mg／kg 8 97.79±39.67麝香通心滴丸组 1mg／kg 8 58.84±29.821）麝香通心滴丸组 2mg／kg 8 78.69±31.201）麝香通心滴丸组 2mg／kg 8 71.95±32.591）与模型组比较，1）P＜0.05

2.6 麝香通心滴丸对AS家兔血清相关炎性因子含量的影响 （见表6）

表6 麝香通心滴丸对AS家兔血清炎性因子含量的影响（±s）

表6 麝香通心滴丸对AS家兔血清炎性因子含量的影响（±s）

组别 剂量 n MCP－1（pg／mL） VCAM－1（ng／mL） TNF－α（pg／mL）正常对照组 － 10 482.47±25.97 3 089.51±434.45 126.90±11.80模型组 － 12 564.04±67.811） 3 652.71±476.991） 161.22±24.291）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 9 561.75±58.69 3 319.54±498.73 146.27±18.95麝香通心滴丸组 1mg／kg 12 505.91±30.52 3 351.31±376.70 141.16±13.641）2）麝香通心滴丸组 2mg／kg 10 495.82±36.52 3 321.07±308.52 132.48±11.711）2）辛伐他汀组 2mg／kg 8 498.97±13.52 3 406.37±404.73 137.77±11.451）2）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

2.7 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉相关炎性因子mRNA表达水平的影响 （见表7）

表7 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉相关炎性因子mRNA表达水平的影响（±s）

表7 麝香通心滴丸对AS家兔主动脉相关炎性因子mRNA表达水平的影响（±s）

组别 剂量 n MCP－1mRNA VCAM－1mRNA TNF－αmRNA正常对照组 －10 1.01±0.48 1.11±0.43 1.17±0.58模型组 － 12 4.45±3.831） 3.51±1.511） 18.67±13.391）麝香通心滴丸组 0.5mg／kg 9 3.87±3.28 2.89±1.36 10.82±9.21麝香通心滴丸组 1mg／kg 12 1.95±1.842） 2.20±1.682） 8.75±8.732）麝香通心滴丸组 2mg／kg 10 3.80±2.37 2.97±1.38 13.26±7.84辛伐他汀组 2mg／kg 8 1.82±1.142） 2.38±1.46 9.19±7.962）与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05

3 讨 论

血脂异常是当今公认的致AS发生的重要原因之一。随着AS的不断发展，斑块中的脂质沉积也不断增多，并逐渐形成脂核。斑块中过大的脂核会增加管壁在斑块肩部的应力，从而升高斑块的易损性，而肩部也是斑块破裂最常发生的部位，可见血脂异常和斑块易损密切相关［5］。本实验观察了麝香通心滴丸对AS家兔血脂的影响，结果显示各剂量组虽有降低TC、TG、LDL的趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。麝香通心滴丸对脂质的影响并非是稳定易损斑块的主要机制。

氧化应激贯穿于AS发生发展的全过程。在AS早期机体抗氧化能力下降，氧自由基生成增加会引起内皮细胞功能障碍，导致单核细胞黏附，脂质沉积于动脉内膜下。而其对于脂蛋白的氧化修饰，特别是ox－LDL的生成则对AS的发生及易损斑块的形成起到了关键的作用。由此可见提高机体抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，降低ox－LDL及MPO的含量应是防治易损斑块的可能途径。本实验中麝香通心滴丸可以明显提高家兔血清SOD的活性，降低血清MDA含量、MPO活性以及ox－LDL含量（P＜0.05）。提高机体抗氧化能力，减轻氧化应激损伤应是其稳定斑块的作用机制之一。

斑块的纤维帽是覆盖于脂核上的纤维肌性组织，主要由少量的平滑肌细胞和细胞外基质（ECM）构成。ECM尤其是胶原纤维合成和降解代谢的失调是造成斑块易损、诱发斑块破裂的重要原因。平滑肌细胞是斑块中ECM合成的主要来源，而其降解则主要是由MMPs来完成的［6］。

斑块中MMPs表达和活性的升高会造成ECM降解的增强，直接导致斑块纤维帽变薄，易损性增加。而TIMP则是MMPs在组织中的天然抑制剂，在体内局部组织的TIMP可以按1∶1的分子比例以非共价键结合活化的MMPs，抑制其对特异性ECM蛋白的降解，也可与酶原结合阻止其活化。MMPs与TIMP的失衡则可以造成斑块内基质代谢失调，直接导致纤维帽变薄、破裂［7－11］。所以抑制 MMPs的过度表达和活性增高也成了防治易损斑块的研究方向之一。本实验显示其可以降低AS家兔血清MMP2含量，升高TIMP2含量，并降低两者比值（P＜0.05）。提示麝香通心滴丸可以通过降低MMP2的含量及活性防止斑块内基质的过度降解，稳定斑块。

炎症反应可以通过释放多种炎症介质增加斑块的易损性，导致斑块破裂：血管内皮受损后 MCP－1、ICAM－1、VCAM－1的协同作用下进入到血管内皮下，并在巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）的作用下活化形成巨噬细胞，通过清道夫受体吞噬ox－LDL，形成泡沫细胞，由于脂质的不断摄入，泡沫细胞最终崩解形成脂核 ，随着脂核的不断增大，斑块的易损性升高。巨噬细胞可以通过分泌IL－1、TNF－α，上调 MMPs的表达，促进斑块内的基质降解，诱发斑块破裂。大量的组织因子，诱发血栓形成［12］。减少斑块内的炎症细胞，抑制相关炎症介质的释放，减轻斑块内的炎症反应是防治易损斑块的主要机制之一。

本实验结果发现，麝香通心滴丸2mg／kg和1mg／kg可以明显降低AS家兔血清TNF－α含量（P＜0.01），而对于血清中MCP－1和VCAM－1含量有降低趋势。麝香通心滴丸可以通过减少斑块内的巨噬细胞，减少TNF－α的分泌，从而减轻炎症反应，防止易损斑块形成。

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