张辉，宋永胜，吴斌

（中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，沈阳 110001）

肾癌是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一，仅次于膀胱肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的85%。既往肾癌就诊时20%～35%已有转移，6%～15%是因为转移症状而就诊［1］，因此加强对肾癌转移的分子机制的研究尤为重要。KISS-1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，能明显抑制肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性，并限制肿瘤细胞的迁移、蠕动功能［2］。本研究拟应用实时PCR检测KISS-1基因和上皮细胞钙粘蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）在肾癌中的表达，并研究KISS-1对肾癌细胞Caki-1中E-cadherin的调控作用。

网络出版时间：2011-09-26 12:08

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

所有组织标本均来源于2007-2010年中国医科大学附属盛京医院泌尿外科患者，包括53例原发未转移肾癌和46例原发伴转移肾癌。患者年龄47～63岁，行经腹腔根治性肾切除术，经病理诊断证实为肾透明细胞癌，均未接受放疗和化疗。组织标本切除后浸入RNAlater，放入-80℃冰箱中保存。人肾癌细胞系Caki-1为本实验室保存；重组真核表达载体pIRES2-KISS1为本实验室前期研究构建。总RNA抽提试剂TRIZOL和转染试剂Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司，大肠埃希菌DH5α、逆转录试剂盒和实时PCR试剂盒购自TaKaRa公司，无内毒素质粒中提试剂盒购自北京天根公司，抗KISS-1和E-cadherin抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中山公司，Western blot相关试剂购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 实时PCR：TRIZOL法提取总RNA，逆转录成cDNA。以β-actin为内参基因，按照试剂盒说明书扩增KISS-1和 E-cadherin基因，KISS-1上游引物：5′-TTCCTCTGTGCCACCCACTT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GCAGTAGCAGCTGGCTTCCT-3′；E-cadherin 上游引物：5′-GCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3′，下游引物：5′-TAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。应用 ABI公司的7500 Real-time PCR仪，7500 Software v2.0软件。实验获得数据采用比较CT值法（2-ΔΔCT法）进行相对定量分析。……