元海成，秦鸣放，邹富胜，张 辰，李东华

急性胆道梗阻可以通过结扎啮齿动物的胆总管复制。大鼠的胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）的模型已经有描述，在以往研究多选择一个或两个研究时间点[1-3]，缺乏对不同时间点相关变化的详细说明。国内文献对胆总管结扎模型的建立过程描述过于简单，甚至无法重复。本研究详述BDL后不同时间点相关变化，为大鼠胆总管结扎模型建立提供影响因素的实验依据。

1 对象和方法

1.1 动物 雄性Wistar大鼠90只。年龄11～13周，体重250～300 g，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心（SCXK津2005-0001）提供。标准条件下喂养，并保持手术前至少7 d的12 h白-黑周期的环境条件。经检疫合格，无疾病者入选。

1.2 分组及造模 采用随机数字表方法分成模型组和假手术组。术前禁食15 h，不禁水，称大鼠质量，以100 ml/L的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，将大鼠固定于手术台上，剑突下上腹部备皮，碘伏消毒。模型组动物脐上腹正中切口2～2.5 cm入腹，暴露胆总管，在肝右叶下缘与胆总管交点处（肝右叶及乳头叶胆管汇入胆总管位置最低，保证在所有肝叶胆管汇入点下方），分离胆总管、以6-0丝线单线结扎胆总管。假手术组动物只剖腹，分离胆总管不结扎。所有动物腹腔滴入0.2 mL左氧氟沙星注射液，关闭腹膜及皮肤层，双层关腹。术后5 h进水，20 h进食。

1.3 观察指标 术后每日观察两组动物活动状态，进食及黄染情况，动物进行称重。第1、2、3、5、7 d，每组各处死8只动物。动物麻醉后，开腹暴露腹腔，腹主动脉抽血约3～5 mL，室温下3 000 r/min离心15 min，取1.5 mL血清，用EP管保存送检，行血清行总胆红素（TBIL）、直胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)生化指标检查。大鼠肝脏右叶切取1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肝组织浸入10%福尔马林液中固定保存，以备HE染色组织学研究。

1.4 肝脏组织学病理观察 依据Metavir肝纤维化评分系统，0级：肝组织未见损伤；I级：肝组织内可见微小损伤；II级：肝脏汇管区出现损伤并蔓延到汇管区以外区域；III级：条索样的肝纤维化并向周围蔓延；IV级：肝硬化或者显著的肝损伤。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0 for Windows统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 术后 5 min左右，大鼠即清醒、站立，30 min后能饮水。模型组动物术后第1 d均有显著的体重减轻，此后体重稳定升高。模型组大鼠在术后2 d时间内活动显著减少，从第3 d开始基本恢复到正常的活动状态，而假手术组动物活力，术后与术前无明显变化。肉眼观察模型组自第1 d开始动物出现黄疸，术后第3 d黄染最明显，之后模型动物黄染程度略有下降。

2.2 肝功能变化 胆总管结扎后血清ALT迅速增加，高峰在术后第1～2 d，于术后第3 dALT迅速下降，术后5～7 d时，血清ALT测得值水平，虽然仍有增高，但总体趋于水平，见图1。

胆总管结扎导致胆汁淤积血清标志物增加，总胆红素、直接胆红素和血清碱性磷酸酶。模型组动物手术后总胆红素和直接胆红素测得值水平，从术后第1 d直到第7 d逐渐上升，术后第3 d测得值最高，之后的增长趋势减缓，见表1。血清碱性磷酸酶变化曲线显示，其测得值于术后第2 d达到高峰期，然后从第3 d起稳步增加，见图2。

TBIL模型组两两比较结果，测得数值1 d和3 d有差别（P=0.000），1 d和5 d有差别（P=0.000），1 d和7 d有差别（P=0.030），2 d和 3 d有差别（P=0.021），2 d和5 d有差别（P=0.027），总胆红素及直接胆红素测得值随着时间逐渐增大，胆总管结扎后第3 d数值最高，见表1。

2.3 肝脏病理变化 根据肝纤维化评分系统，模型组不同时间点肝纤维化程度评分，见表2，而假手术组肝组织7个时间点未见明显变化，均在评分系统的0级。

表1 模型组和假手术组大鼠血清TBIL、DBIL检测结果比较（±s，umol/L）

表1 模型组和假手术组大鼠血清TBIL、DBIL检测结果比较（±s，umol/L）

注：与同时间点假手术组比，*P＜0.01

术后模型组假手术组n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 1 2 3 5 7 1 2 3 5 7 TBIL 116.76±52.63*182.66±75.1*241.07±78.64*218.4±14.58*189.2±28.11*1.98±0.31 1.24±0.53 2.13±0.39 1.16±0.43 1.08±0.33 DBIL 76.34±27.47*116.67±41.75*198.63±51.01*136.55±7.30*121.9±17.14*1.51±0.23 0.75±0.31 0.76±0.15 0.77±0.19 0.59±0.47

图1 血清ALT指标变化曲线

图2 血清ALP指标变化曲线

表2 模型组各时间点肝纤维化病理组织学评价

3 讨论

血清碱性磷酸酶和胆红素，是临床上胆道梗阻胆汁淤积症的传统检查指标[4]。实验发现胆总管结扎后，血清碱性磷酸酶测得值曲线，不是渐进增加，其增长的第一个高峰期在胆管结扎后的2 d，然后从第3 d至7 d逐渐减少，血清碱性磷酸酶的增高，是由于急性胆道梗阻后，肝细胞受损肝脏应激反应，使其在肝脏中重新合成。ALP的增高表明急性损伤触发肝脏大规模生产和释放这种酶。此后血清碱性磷酸酶水平出现稳步增加，是由于机体内胆汁酸水平持续增高引起。

在本研究中我们发现，胆总管结扎后第1 d开始，肝细胞发生变性坏死逐渐程度加重，伴有大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，伴随着肝细胞间的纤维组织增生，出现纤维化，但未发现典型的肝脏假小叶形成，证明梗阻7 d后，肝脏只有轻度的纤维化，没有发生肝硬化，从临床治疗角度说，若急性胆道梗阻后1周内，及时引流胆道及保肝治疗，病情可得到控制，肝脏的病理改变尚能逆转。这些实验数据也为临床治疗对病程与病情的相互联系，提供了依据。

胆总管结扎后，血清中的胆道梗阻指标总胆红素、直胆红素在梗阻后迅速升高，术后第3 d测得值最高，术后第5 d及第7 d胆红素测得值无明显增高，但仍处于高水平。肝脏细胞损伤指标谷丙转氨酶，亦以术后第3 d为转折点，结合HE染色术后第3 d开始，肝脏标本病理改变加重结果，可以推论急性胆道梗阻后第3 d，肝脏细胞对急性损伤反应逐渐强烈，而梗阻3 d后机体开始进入自我调节及修复过程，肝脏细胞通过修复、增生等多种方式，逐渐减轻急性胆道梗阻后的损伤，及适应梗阻性黄疸的病理环境。所以实验中后2个时间点血清中的胆红素水平增高不明显，甚至略有下降。肝胆外科临床上胆道梗阻病人当发病24～48 h后，应该测定急性胆汁淤积性肝损伤的程度，积极评估病情。

早在1983年，Bioulac-Sage等[5]已经开始研究选择性胆管梗阻大鼠动物模型，他们发现梗阻的肝叶与非梗阻的肝叶之间存在这大量的胆管侧枝交通，通过这些交通枝可以缓解胆管梗阻侧的胆汁淤积[6]。造模后实验动物血清胆红素的并非呈现陡峭的递增趋势，而是出现波动性上升，术后第5、7 d的TBIL及DBIL的测得数值较第3 d的数值下降，造模成功率不能达到100%，可能与潜在的胆道侧枝形成，代偿了胆总管梗阻及个体差异有关。

胆道梗阻病理状态可通过接扎Wistar大鼠胆总管成功复制，胆总管结扎后生化指标波动性变化。胆总管结扎后第3 d，是肝脏生化指标变化的转折点，也是急性损伤反应最强烈的时间。

[1]P.Georgiev,W.Jochum,S.Heinrich,et al.Characterization of time-related changes after experimental bile duct ligation[J].Br J Surg,2008,95(5):646.

[2]Georgiev P,Navarini AA,Eloranta JJ,et al.Cholestasis protects the liver from ischaemic injury and post-ischaemic inflamemation in the mouse[J].Gut,2007,56(1):121.

[3]Lunz JG III,Tsuji H,Nozaki I,et al.An inhibitor of cyclin-depen⁃dent kinase,stress-induced p21Waf-1/Cip-1,mediates hepatocyte mito-inhibition during the evolution of cirrhosis[J].Hepatology,2005,41(6):1262.

[4]Czauderna M,Kowalczyk J,Marounek M.The simple and sensitive measurement of malondialdehyde in selected specimens of biologi⁃cal origin and some feed by reversed phase high performance liq⁃uid chromatography.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci[J].2011,879(23):2251.

[5]Bioulac-Sage P,Dubuisson L,Bedin C,et al.Failure to induce se⁃lective Cholestasis in the rat after long-term extrahepatic selective biliary obstruction[J].Liver,1983,3(5):338.

[6]Ni Y,Lukito G,Marchal G,et al.Potential role of bile duct collat⁃erals in the recovery of the biliary obstruction:experimental study in rats using microcho-langiography,histology,serology and magnet⁃ic resonance imaging[J].Hepato-logy,1994,20(6):1557.