崔可赜,张明磊

(1.海口市人民医院 骨科,海南 海口 570208;2.吉林大学中日联谊医院 骨科,吉林 长春 130021）

当细胞植入体内后,必须尽快发生血管化,建立血液循环,通过血液-细胞间液使细胞获得营养及氧气,维持其活力,进而发挥成骨作用,修复骨缺损。充分的血液供应是保证细胞在体内存活的决定性因素。在应用大块组织工程骨修复骨缺损时,其核心部位往往发生缺血性坏死,其原因是不能实现早期的血管化,导致支架中心的细胞因无法进行正常的新陈代谢而大量死亡[1]。有研究表明,植入体内后,远离毛细血管200 μ m以上的细胞将因为得不到营养和氧气而死亡,限制了在临床上的应用[2]。血管化已经成为骨组织工程的关键技术,能够将氧气及营养物质携带到局部微环境中,带走新陈代谢产生的废物及坏死分解产物,以维持一个动态的局部微环境。

1 材料和方法

1.1 材料pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,LIPofectamineTM脂质体转染试剂盒(Gibco公司）,DMEM培养基(美国Gibco公司）,胎牛血清(美国Hyclone公司）,SP免疫组化试剂盒、DAB,兔抗人VEGF抗体(Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的转染 转染前一天,采用胰酶消化法将处于对数生长期的细胞制备成单个细胞液,计数后调整细胞浓度为2×105细胞/ml,接种于6孔板,每孔2 ml。次日细胞融合铺满板底80%左右时进行转染。转染采用LIPofect-amineTM试剂盒进行。

1.2.2 转染后的观察及计算转染率 细胞转染48小时,光镜和荧光显微镜下观察细胞转染后荧光表达情况。

转染效率计算:10个视野转染阳性细胞数之和/细胞总数之和=该孔细胞转染效率。……