夏 莉,刘玉侠,迟艳飞,王 娟,高 峰,李 岚,于 军,刘柏林

(1.吉林省人民医院 肿瘤科,吉林 长春 130021;2.吉林省肿瘤防治研究所,吉林 长春 130012）

T细胞可依据表面受体(TCR）的不同表达而分成两类:TCRα β 细胞和TCRγ δ细胞 。其中 γ δ T 细胞是一个数量较小的亚群,约占正常人外周血T淋巴细胞总数的1%-10%。在肿瘤免疫中γ δ T细胞对肿瘤抗原的识别不具组织相容性抗原复合体(MHC）限制性及不需特异的抗原呈递作用,且对多种肿瘤细胞具细胞毒活性。

为深入研究γ δT细胞在肝癌免疫治疗中的作用,我们采用T 细胞受体γ δ T 单抗,IL-2,HSP70体外选择性扩增正常人外周血γ δ T细胞,并制备和鉴定HSP70-抗原肽复合物,体外诱导γ δT细胞生成,比较不同诱导方法γ δ T细胞的产生率,为进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

IMDM、MTT:Sigma公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;PE anti-human γ δ T Cell Receptor(B1）:BioLegend;抗 TCRγ δ单抗 :Immunotech;IL-2:北京四环生物制药有限公司;淋巴细胞分离液:中国科学院血液学研究所;蛋白分子量Marker:中国科学院上海生命研究所。

1.2 方法

1.2.1 HSP70-抗原肽复合物的制备及鉴定 取对数生长期的SMMC-7721细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,调细胞浓度为1×107/ml,43℃水浴热休克2 h,37℃恢复 2 h,反复冻融(-196℃,37℃）细胞 3次,高速离心(15 000 r/min,1 h）,收获上清液,用紫外分光光度计测蛋白浓度,0.22 μ m滤器除菌,-80℃冰箱分装冻存。

1.2.2 外周血淋巴细胞的分离:按说明书进行。

1.2.3 γ δ T细胞诱导方法 将分离的淋巴细胞接种到24孔细胞培养板,1×105/ml,1 ml/孔,按以下顺序分组并加细胞因子,每3天半量换液。

第 1 组 :γ δ T cell receptor(0.4 μ g/ml）

第 2 组 :γ δT cell receptor(0.4 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

第 3 组 :γ δT cell receptor(0.4 μ g/ml）+HSP70(20 μ g/ml）

第 4 组 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）

第 5 组 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

第 6 组 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）+HSP70(20 μ g/ml）

第7 组 :HSP70(20 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

1.2.4 γ δ T细胞鉴定 取加不同细胞因子诱导的γ δ T 细胞,离心(1 000 rpm,5min）后用PH7.2 PBS 洗1次……