廖 艳,袁晟光,廖维甲*,覃理灵,梅铭惠,陈 谦

(1.桂林市疾病预防控制中心,广西桂林 541001;2.桂林医学院附属医院肝胆外科研究室）

生存素(survivin）是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族新成员,在多数恶性肿瘤组织中表达丰富,但在相应正常成人组织中低表达或不表达,这种选择性表达特性使其成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点[1]。Zhu等[2]及笔者课题组前期研究也发现肝细胞癌(HCC）组织中存在survivin的高表达[3]。RNA干扰技术(RNA interfering,RNAi）是近年来迅速发展起来的生物技术,已成为基因功能研究以及基因治疗的强有力工具[4,5]。RNAi技术在疾病的基因治疗上具有光明的应用前景,如肿瘤以及病毒感染等。因此,我们利用siRNA建立起一种转录后沉默(PTGS）的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA）来沉默肝癌细胞中survivin表达的方法,对肿瘤细胞生长的影响,为肿瘤的基因治疗提供新的方法和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料肝癌细胞系BEL-7404为北京大学肝病研究所惠赠,E.coli菌为本实验室保存;DEME、Trypsin-EDTA、G418、胎牛血清和卡钠霉素购自GIB-CO公司;脂质体LipofectamineTM 2000和TRIzol购自Invitrogn公司;LB培养基、内切酶HindⅢ、BamHⅠ、TaqDNA聚合酶和DNA maker等酶购自华美生物工程公司;PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司;甲基噻唑蓝(MTT）和二甲基亚砜(DMSO）购于Sigma公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人Survivin单抗、羊抗小鼠IgG和DAB显色试制盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;质粒抽提试剂盒购自北京三博远志生物技术公司。

1.2 设计合成pGenesil-1/Survivin载体的DNA片段pGenesil-1/survivin表达载体合成及细胞转染参照Harborth等[6]的干涉 RNA设计原则,和survivin(NM_001168）编码序列,并利用 BLAST进行查询,确……