成国涛 周 婵 侯春春 徐 水

(西南大学生物技术学院，重庆北碚 400716)

血液在正常情况下自己会自动从流动态变为不流动的凝胶态，正是依赖于血液这一性质，动物体才不会因为小小的出血而丧生。但这一保护机制有时候却会给我们带来麻烦，例如，它会在正常的人体内形成血栓，从而造成心脑血管方面的疾病;还有，我们在血液透析的时候不希望血液凝固。因此，抗凝血类药物一直是我们孜孜以求的。随着人工器官、组织活性生物材料和装置的迅速发展，对生物医用材料的抗凝血性要求也越来越高。凡是与血液直接接触的生物医用材料，如人工心脏、人工血管、人工心血管的辅助装置及各种进入或留置血管内与血液直接接触的导管、功能性支架等医用装置等，都要求与血液接触后不引起血浆蛋白的变性，不破坏血液的有效成分，不导致血液的凝固和血栓的形成，即对材料的抗凝血性都有一定的要求[1-3]。因而，如何提高生物医用材料的抗凝血性是内植性高分子生物材料较为活跃的一个研究领域。

丝素蛋白是一种天然蛋白质，因其良好的机械性能、生物相容性和易于加工等特点，在组织工程材料中得到越来越广泛的研究与应用[4]。近年来，国内外以丝素蛋白为素材，开展了抗凝血剂和抗凝血材料的研究[2-3]。本文拟对改性丝素蛋白作为抗凝血材料的抗凝血机理、制备方法及其研究新进展进行概述。

1 改性丝素抗凝血材料研究进展

1.1 硫酸化丝素

通过对丝素蛋白的结构研究发现，丝素包含有三类蛋白:重链蛋白(H-链，350 kDa)、轻链蛋白(L-链，25 kDa)和P25蛋白(30 kDa)。这三类蛋白的比例是H-链∶L-链∶P25=6∶6∶1。在H-链蛋白中主要是Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser这样的氨基酸排列[5]，其中Ser之间的距离，与目前广泛使用的抗凝素—肝素中有抗凝血作用的重要基团硫酸基的距离十分相近。对肝素抗凝作用机制的研究表明，肝素类药物本身不具有直接的活性，其抗凝作用在于肝素分子中的葡糖胺单元中含-NH-SO3-基团，该基团可与抗凝血酶(antithrombin，ATIII)特异地结合，从而使抗凝血酶的构型发生改变，暴露出活性中心，使血浆中的凝血因子IIa(凝血酶)，IXa，Xa，XIa和XIIa等失去活性[6]。因此，在其他材料中构建类似的结构或引入-NH-SO3-基团，该材料就具备抗凝血功能。研究表明，在其他材料中引入硫酸根或磺酸基团，可以不同程度的改善材料的抗凝血性[7-8]。因此，若能在丝素蛋白Ser残基上引入硫酸基或磺酸基，制造出类似肝素的结构，则可赋予丝素抗凝血作用。

日本科学家[9]的研究工作证实了这一点。用浓硫酸在一定温度下处理丝素水溶液一定时间，用NaOH中和后，将硫酸化的丝素溶液透析脱盐，经冷冻干燥后得到硫酸化丝素粉。用傅立叶转换红外光谱检测硫酸处理的丝素被导入硫酸基的情况，结果表明丝素蛋白分子中的酪氨酸或丝氨酸的羟基被硫酸酯化，形成的硫酸酯基在1100～1400 cm-1处有强烈吸收峰，说明丝素蛋白中被导入了硫酸基。将抽出的血液注入试管，在5 min内，血液就自动凝结，而在添加了硫酸化丝素粉的试管中的血液，即使经过2 h以上，也不产生凝固反应，从而说明了硫酸化丝素蛋白可以使血液的凝固时间延长，但较肝素的抗凝活性低。

为了提高硫酸化丝素的抗凝性，日本的Tamada Y.用氯磺酸代替硫酸进行了硫酸化丝素蛋白的制备，并对其凝血性能进行了测试[7，10]。结果发现，用氯磺酸代替硫酸制备的硫酸化丝素，其抗凝活性提高了100倍。但是即便如此，它的活性仍然远远不及肝素。通过Tamada Y.的研究分析发现，丝素硫酸化接枝反应主要发生在丝氨酸和酪氨酸残基上。氨基酸组成分析发现硫酸化主要发生在H链，硫酸化丝素仍然保持丝素分子的结晶区。硫酸根接枝量随反应时间的延长而提高，酸量滴定法测得其最大硫酸根接枝量为1.0 m mol/g，硫酸化效率为66.7%。进一步的研究分析表明硫酸化丝素的抗凝血性主要取决于硫酸根量，表明硫酸根的引入导致了丝素蛋白的抗凝血。

除用氯磺酸硫酸化丝素外，李圣春等用吡啶三氧化硫硫酸化丝素，制备了水溶性的硫酸化丝素抗凝血材料，并对其抗凝血性能进行了检测[11]。结果表明，处理6h后含硫量达到最大值(1.26 m mol/g)，比 Tamada Y.报道的最大含硫量(1.0 m mol/g)高出25%。但遗憾的是，抗凝血效果依然不及肝素。以上研究表明，影响硫酸化丝素抗凝血性的关键在于硫酸根的接枝量，由于硫酸化接枝反应主要发生在丝素蛋白分子中的丝氨酸和酪氨酸残基上，而这两种氨基酸在丝素中的含量只有25%左右，这是影响硫酸根和磺酸根接枝量，进而影响抗凝效果的根本原因。

小直径血管移植失败的一个重要原因是其腔内表面不能及时得到内皮细胞(ECs)流而容易形成血栓，如果支架能很好的抗凝血以等待血管细胞生长形成光滑的腔内表面将有望解决上述问题。Haifeng Liu利用静电纺丝技术将氯磺酸处理过的丝素蛋白制成丝素纳米支架[12]，其抗凝血性和相容性的体外评价结果表明，硫酸化纳米丝素支架的抗凝血性显著增强，血管细胞(内皮细胞ECs和平滑肌细胞SMCs)对该支架显示出很强的粘附能力且增殖良好，这对血管组织的成功重建意义重大。

自然界除桑蚕(因家蚕取食桑叶称为桑蚕)外，还有很多非桑蚕也吐丝营茧，如取食柞树叶的柞蚕(Antherea pernyi)，取食蓖麻叶的蓖麻蚕(Philosamia cynthiaricini Boisduval)，以壳斗科柞属植物的叶为食的天蚕(Antheraea yamamai Guerin-Meneville)和取食楠木叶的琥珀蚕(Antheraea Assama)等。这些非桑蚕的茧和丝和桑蚕茧丝具有相似的性质和用途，因而受到广泛的关注和研究。Kasoju，N等用琥珀蚕丝丝素作为基材制作了功能支架，并对支架表面进行硫化修饰以期改善材料的血液相容性。扫描电镜(SEM)结果显示硫化对支架的架构没有影响，热重分析(TGA)和亲水性实验结果表明支架的热稳定性和亲水性得到增强;体外溶血实验，蛋白吸附和血小板粘附实验结果表明该支架的血液相容性明显改善;体外细胞毒性测试结果表明该支架无毒，可支持细胞粘附和生长[13]。

1.2 中药活性成分改性丝素

川芎嗪，化学名为2，3，5，6-四甲基吡嗪(TMP)，是活血化淤中草药川芎的主要有效成份之一，现在已可人工合成。临床治疗及药理研究表明川芎嗪具有改善微循环、抑制血小板聚集、防止血栓形成等作用，并且从上世纪70年代起已成为国内临床治疗心脑血管病的常用药物。连小洁等尝试用川芎嗪及其衍生物对丝素进行改性。首先在川芎嗪的侧链进行结构修饰引入活性基团羟基，然后通过酯化反应引入双键，将得到的中间体进一步在无引发剂条件下接枝聚合在丝素材料表面。结果表明，和未改性丝素相比，改性后的丝素部分凝血活酶时间(APT T)延长，同时在富血小板血浆中培养30min后未发现有粘附的血小板，说明川芎嗪衍生物改性丝素材料的体外抗凝血活性有所改善[14]。她还将川芎嗪结构修饰得到的化合物接枝到聚丙烯酸(PAA)上，提高其稳定性，然后与丝素共混制备共混膜，结果同样获得了抗凝效果不错的抗凝血材料[15]。

Song W.等将原儿茶醛(活血化瘀中草药丹参的主要活性成分)接枝聚合在丝素蛋白表面，结果表明改性后的丝素蛋白材料抗凝血性能有了明显提高，而且细胞亲和力得到增强[16]。利用活血化瘀中草药的活性成分对丝素蛋白进行改性修饰以其提高其抗凝血性的方法，为我们在抗凝血丝素材料的研究上提出了新的思路。但中草药改性丝素抗凝血材料的抗凝血原理和抗凝机制目前还未见报道。

1.3 肝素化丝素抗凝血材料

肝素本为抗凝血剂，将肝素固定在丝素材料表面或混入丝素中对丝素进行改性，可制备抗凝血材料。冯桂龙等以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(简称EDCI)为缩合剂对改性丝素/胶原膜进行了肝素固定化，肝素固定化的丝素改性胶原膜具有良好的抗凝血性[17]。程忠玲选用酶法制备的胶原与肝素化胶原共混，采用戊二醛作为交联剂，在25℃、相对湿度为65%的环境下干燥72 h，制备了肝素化胶原/丝素共混膜。共混膜的活化部分凝血活酶时间(APT T)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)分别超过150s、200s、50s[18]。叶勇等利用等离子体处理技术使丝素膜表面被激活，以戊二醛作为交联剂，接枝肝素分子进行丝素膜表面抗凝血性修饰。单因素优化实验结果显示:经等离子体和戊二醛处理后的丝素膜与肝素溶液的较好反应条件为pH 1.5、40℃、4 h，该条件下丝素膜表面肝素含量为37.62μ g/g。经体外凝血试验检测，接枝肝素分子后的丝素膜具有较强的抗凝血活性;经稳定性试验分析，肝素与丝素膜结合稳定牢固不易被洗脱，提示其结合方式为共价键结合[19]。

除纯丝素肝素固定化外，丝素共混材料的肝素共混和固定化也可制备抗凝血材料。She等将肝素在温和的条件下加入丝素/壳聚糖支架中。各种分析结果表明，加了肝素的丝素/壳聚糖支架维持了丝素基材支架的多孔性和良好的机械性能，并有效增强了其抗凝性，导致支架可以与血液兼容[20]。为控制肝素的释放，延长材料的抗凝血作用时间，Xiu-Ying Liu等在聚氨酯和丝素蛋白共混膜中载入肝素制备了肝素缓释体系。该体系中，肝素的释放率和累计释放比例可由膜上载入的肝素量，丝素蛋白与聚氨酯的组成比例以及膜厚度来控制。增加膜厚度，提高肝素载入数量及提高膜中的丝素蛋白量可以更慢更持久的释放肝素。复合膜保持了肝素高的生物活性和持久的抗凝血酶时间，凝血时间实验表明该复合薄膜具有良好的血液相容性[21]。

Shudong Wang等利用静电纺丝技术制备了两种静电纺肝素改性丝素纳米材料，体外凝血测试结果表明该丝素纳米材料的抗凝血性远高于纯丝素。此外，L929成纤维细胞和EVCs在肝素改性丝素纳米材料上的扩展增殖好于纯丝素材料，而且未观察到巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞，表明该材料在机体内不会引起严重的炎症[22]。

1.4 接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆酰的丝素蛋白材料

Furuzono等用2-甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯的乙烯基对丝素进行改性，然后采用偶氮聚合引发剂将其接枝在改性的丝素上。接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆酰的高分子材料具有类磷脂结构，其表面可强烈吸附血液中的磷脂分子，在材料表面形成单层完全覆盖的类似生物体表面的磷脂层，使血浆蛋白和血细胞与材料表面的相互作用变弱，从而有效抑制材料表面的血浆蛋白吸附、血小板黏附以及血小板的活化，阻碍血栓的发生。体外血小板黏附实验证实，接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆酰的丝素比对照丝素的血小板黏附显著降低。同时发现接枝率在6.9%，17.2%和26.3%的丝素三者之间的血小板黏附数量并无显著性差异，说明在所研究的范围内血小板黏附数量与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆酰接枝到丝素上的数量没有关系[23]。

1.5 接枝褐藻多糖硫酸酯的丝素蛋白材料

褐藻多糖硫酸酯是从褐藻中分离出的一种独特种类的硫酸基多糖，是目前除肝素外研究较多的有效抗凝血剂之一。程忠玲等利用等离子体技术在其表面上接上氨基，采用戊二醛为交联剂，将褐藻多糖硫酸酯固定在丝素膜的表面上。抗凝血活性评价结果表明:改性丝素膜的APT T和TT比未处理的纯丝素膜、NH3等离子体处理丝素膜分别延长35s和4s[24]。利用X射线电子能谱进行丝素蛋白膜表面元素分析，发现APT T、T T随着改性丝素膜表面硫含量的增加而增加，说明接枝膜的抗凝血活性依赖于其表面的抗凝血剂的硫酸根含量[25]。褐藻多糖硫酸酯是利用其带有的硫酸基等负电荷基团与HCⅡ结合，而形成的复合物又与凝血酶结合，从而在空间结构上阻碍了凝血酶的活性。同时褐藻多糖硫酸酯也结合在纤维蛋白原的碱性氨基酸残基如精氨酸或赖氨酸上，使凝血酶无法接近并作用于纤维蛋白原，因此，抗凝血主要是增强HCⅡ对凝血酶活性的抑制和抑制纤维蛋白原的凝结来延长凝血时间[26]。

1.6 磺酸化丝素

顾晋伟等首次采用二氧化硫等离子体处理丝素薄膜，在其表面引入磺酸基团;同时用氨气等离子体处理丝素蛋白膜后在表面接入氨基，利用1，3-丙磺酸内酯与氨基的反应在材料表面接枝磺酸基团。X射线电子能谱的分析结果表明，丝素膜表面仅有微量的硫元素(0.32%)，经过二氧化硫等离子体处理后丝素膜表面的硫元素含量上升到4.03%。全反射红外光谱在1 160 cm-1附近出现一个新的吸收峰，归于磺酸基团-SO3H中S=O键的对称伸缩振动。体外抗凝血实验结果表明，APT T和T T分别超过150 s和90 s，而PT变化不大，表明材料表面接入的磺酸基团与部分凝血活酶时间所涉及的凝血因子产生相互作用，从而抑制其中的凝血因子的活性，而且对纤维蛋白原也有相当的抑制作用，结果表明二氧化硫等离子体改性的丝素蛋白材料在抗凝血性方面具有优越的性能[27]。

在实用化的医学组织工程方面，李少彬等采用低温等离子体技术处理普通聚四氟乙烯人工血管内表面，将制备并浓缩到一定浓度的丝素蛋白溶液均匀涂覆到人工血管内表面，再次使用低温等离子体技术对人工血管内表面的丝素膜进行磺酸化处理。以普通聚四氟乙烯人工血管为对照，进行接触角及磺酸化效果检测。结果表明:氩气低温等离子体处理前后接触角分别为87.7°和65.1°，涂覆丝素蛋白后接触角为106.2°，二氧化硫低温等离子体处理后接触角为92.9°;X射线光电子能谱仪检测对照丝素膜表面仅有微量的硫元素(0.12%)存在，经过二氧化硫等离子体处理后丝素表面的硫元素含量上升到2.89%;X射线光电子能谱图中的S2p峰拟合曲线显示了复合血管表面的S原子主要是磺酸基团(-SO3H)，说明实验已制备出理论上具有抗凝血性能的血管[6]。

2 展望

综上所述，通过对丝素蛋白进行各种修饰改性，可以使本身不具有抗凝血效果的丝素蛋白获得抗凝血性，这大大提高了丝素在组织工程材料方面的应用潜力和价值。部分研究已将其应用在人工血管的制备上[6，12]，血液相容性和适应性良好，为丝素抗凝血组织工程材料的进一步应用奠定了坚实的基础。但是，血液凝固机制十分复杂，改性丝素该凝血材料的抗凝血机理，以及抗凝材料表面微观结构与抗凝血性之间关系的研究还很不完善，尚需进一步研究。随着抗凝血机制和改性方法的深入研究，相信丝素蛋白材料在抗凝血剂和抗凝血材料领域将有很大的应用潜力。

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