谢 敬 冯 鑫

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

0 引言

目前人们生活的时代是史无前例的，人类基于可利用能源资源来谈经济发展。美国的政治经济文章中也有相关报道，可持续利用资源已成为热门话题。在过去，人类遭受周期性波动的石油危机上上下下已大致超过30年。研究者已经提出有关的经济技术方法来克服石油进口依赖性，并依据强有力的科学根据来面临此次挑战。目前，与社会和经济能源部门有关的全球环境问题已占国际议程的主要部分。很明显可以看出，归于石油经济本身的生命周期，石油能源马上就要走到尽头。因此，预测并避免未来能源供应短缺问题，以及获得新生物能源替代市场是非常重要的。

1 中国的能源问题

石油及其衍生物已经占领了经济市场，对多种工业部分来说都是一种重要的商品，人们将它们转化成产品以及服务来满足需求。目前，中国正处在一个工业化的发展时期，石油需求量高速增长，我国原油消费量以年均5.77％的速度增加，而同期国内原油供应增速仅为1.67％，供需缺口逐年拉大。由于我国石油消费增长迅速，并受石油资源的限制，使中国对外依存度将进一步提高，石油供应中断风险持续加大，安全形势不容乐观［1］。估计到2020年，中国石油消费量将达4.5～6.1亿t，中国石油缺口量将达两亿多吨。同时，石油消耗的加速使我们面临严重的气候变化，并逐渐降低人们的生活环境质量。目前，全球能源消费79％来自化石能源、35％来自原油、23％来自天然气、21％来自煤炭、9％来自水力和核能、12％来自木柴和风能以及太阳能，微生物也可帮助解决若干能源问题［2］，有关描述如下。

2 汽油与生物燃料乙醇

生物乙醇和其它生物燃料对于促进能源独立和减少温室气体排放是极其重要的。有关可再生替代资源（如生物燃料）逐步代替石油的问题，在全球政治和经济议程中存在很强的争议［3］。作为生物燃料的生物乙醇与汽油的特性比较如下：⑴优点：增加能源安全；提供一个有利的贸易平衡；极好的交通燃料；更清洁更有效的燃烧；高辛烷值；取代四乙基铅作为辛烷值增加剂；其低挥发性降低了烟雾形成；降低了温室气体的排放；减少了微粒和有毒物质的排放；减少了臭氧前体的排放水平，避免空气污染；对人类毒性低，不含硫；替代MTBE进行氧化。⑵缺点：只含有2/3能量；当与汽油混合超过总燃料的15％时，需修改发动机；无法通过管道运输。

2.1 玉米生产乙醇

在国际市场上，生物乙醇主要由糖和玉米淀粉制得。20世纪80年代美国玉米生产生物乙醇就已经达到商业化，并有多个民营企业开始用玉米生产乙醇。自80年代初，燃料乙醇可以与汽油以任何比例混合使用。多年来，乙醇的生产量已经增加，在1979年产量只有378万L，1987年3.4亿蒲式耳玉米生产了32亿L的无水乙醇，这满足了人们3％的汽车燃料需求，2003年生产了106亿L［4］，而在2007年生产量超过了227亿L。

用玉米每年可产492亿L乙醇，但随着以玉米为原料产乙醇的进一步扩大，将导致粮食及食品价格猛涨，形成经济危机。况且玉米制得的乙醇仅能满足国家交通需求的2％。如果乙醇的需求量仅仅由玉米提供，那将要超出目前的玉米产量，并对粮食作物产生威胁。由于玉米的供应有限和基础设施限制，导致生产能力不能无限的扩大，从而使玉米产乙醇量有一个上限。美国政府估计玉米产乙醇的量每年不会超过378～568亿L［5］。因此，玉米并不能真正解决未来的能源问题。在将来，木质纤维生物质将会对不依赖化石能源提供一个平台。

2.2 甘蔗生产乙醇

历史上，巴西在可再生液体燃料方面是一个主导国家，在那儿人们用甘蔗生产乙醇。自90年代以来，此挑战性项目可满足90％新型轿车对纯乙醇的需求，并可满足对含20％～22％乙醇的混合汽油的需求。2005年期间，混合汽油乙醇含量提高到25％。巴西的可再生燃料进程在全世界一直是个很好的例子。在2003～2004作物年度，乙醇的产量达到143.8亿L，这满足了巴西国内40％的燃料消耗量［6］。其中乙醇价格是汽油的65％，并且副产物甘蔗渣可用于发电。

2.3 农林业木质纤维素生物质生产乙醇

由于没有足够的玉米生产乙醇，更多的乙醇产量来自生物质。有关可再生原料的问题，将生物燃料部门的视野从粮食和谷类作物转移到非食品木质纤维素生物质上是非常重要的。另外，纤维素乙醇在能源平衡方面比玉米乙醇好5倍，并且生产生物质乙醇所需能量比其提供能量的10％还要低［7］。每年可用的生物质储量约为1.8～2.0亿t（t为干吨：扣除水分后的重量），以302L/t（干吨）的产量可生产出605.7亿L的乙醇［8］。据美国农业部门和能源部门估计，农业和林业每年分别可产10亿t和3亿t生物质，这可生产出3028.3亿L的生物能源，满足了30％～40％的使用量，并且此需求可通过在农业和林业的土地利用上做相对适中的变化来实现。在亚洲，稻草可作为较好的基质产生物乙醇，其中稻草的成本（27美元/t）比石油的成本（340美元/t）少［9］，也比玉米和小麦（135美元/t）或糖（340美元/t）的成本少，并且稻草构成了世界农业量的一半，如果将它燃烧会引起健康和环境问题。

废品中的木质纤维素是廉价的、大量的和可再生的。它是用于转换燃料最丰富的可再生自然资源，它含有的纤维素和半纤维素成分可以转化成低聚糖、己糖和戊糖与木质素，因此它们可以成为对自然资源合理利用的替代方案，即通过廉价的可再生原料来增加生物燃料的生产量，并能在产生较小的温室效应下改善能量平衡。大量城市及工业废品也有助于解决目前的污染问题，若纤维素生产乙醇成为现实，那么下一个重点将是这些废料资源［10］。

与汽油相比，木质纤维素乙醇的温室气体排放量约减少80％，而玉米乙醇减少了20％～30％。生物能源作物可以转化大气中的CO2成为有机碳来平衡CO2排放物。农业残余物是可持续的、大部分未经开发的、廉价的，它们包括叶、茎和花梗（但不包括果实和种子），这些资源来自玉米纤维、玉米秸秆、甘蔗渣、水稻壳、木本作物和森林中的残留物等。同样，有很多资源来自工农业生产过程中的废料，如柑橘皮、木屑、纸浆、工业废物、城市垃圾和造纸污泥。另外，用于生物燃料的专用能源作物还包括柳枝和多年草本植物（如芒草、百慕大群岛草、象草等），它们具有以下优点：理想的环境质量、可以有效的利用水资源、高作物产量（12.3t/ha，t为干吨）、防止水土流失、促进土壤肥力并且需要很少的化肥和杀虫剂。研究表明柳枝转化生物乙醇的五年田间试验是非常成功的，并说明了多年生作物（如柳枝）比一年生作物（如玉米）更好［11］。相对于一年生作物，多年生作物需要更少的农业投入。同时，可计算出柳枝转化乙醇得到的可再生资源比转化过程中消耗的能源多500％以上，并且在温室气体排放上有明显的优点。

除了纤维素和半纤维素，另一个重要的生物质成分是木质素，它是一个复杂的芳香族聚合物，其中包括15％～25％的植物生物量和40％的能源，木质素作为发电（热能和电力）的能源源泉（锅炉燃料）具有相当的潜力。木质素在分馏和转化操作中作为一个副产品，它本身是一个可再生燃料，能排放最少的温室气体，因为它产生的CO2可以由生长的植物生物质吸收［12］。因此，木质素有足够的能量带动发酵过程并产生电力来出售。

另外最值得人们注意的是，相对于玉米生产乙醇，纤维素发酵过程中的生物质原料需要更先进的预处理，以便使纤维素、半纤维素和木质素的可发酵糖解链［13］。

2.4 纤维素水解过程中发酵糖解链的困难

木质纤维素很难被水解，是因为（1）与半纤维素结合（2）周围环绕着木质素，使其与半纤维素共价结合（3）大部分具有晶体结构，有四个分子内氢键和两个分子间氢键，拥有一个高度有序紧凑的结构［14］。因此为达到经济效益，就需解开被木质素密封包围的纤维素和半纤维素多聚糖中的可发酵糖。为了解构高度有序紧凑排列的晶体和无定形纤维素区，前处理技术是非常重要的，这有助于破坏结晶，去除木质素，增加孔容，并溶解纤维素和半纤维素，从而使目的聚合物容易受酶的作用。通过生物质预处理技术的协调发展努力，连续技术优化是一个非常活跃的领域，在进入微生物发酵阶段前致力于提高发酵糖的总收率［15］。

3 生物乙醇的生产

3.1 酵母菌

糖或多糖（可解聚成发酵糖）发酵的主要代谢产物是乙醇，酿酒酵母可用于己糖发酵，而赤毕酵母或念球菌可用于戊糖发酵。在最佳条件下，酿酒酵母对糖发酵5d可产生10％～12％体积的乙醇，这种高浓度会减慢酵母的生长并使其停止发酵。对特殊的酵母菌，当酒精浓度为20％体积时发酵还可以继续进行，不过这个浓度在发酵数月或数年后才可以达到。目前，所有含酒精的饮料都是由发酵制得，工业酒精主要是由发酵制得，但在石化工业中有一些仍是由乙烯制得。一份酿酒酵母发酵糖得乙醇的清单［16］如下：蔗糖96h内产量97g/L，甘蔗糖蜜30h内产量70g/L，甜菜蜜糖192h内产量53g/L。

为了提高酵母发酵生产乙醇的产量，研究者进行了很多基因操作。例如，消除3-磷酸甘油脱氢酶基因gdp1和过度表达谷氨酸合酶基因glt-1来增加酿酒酵母生产乙醇的产量，同时降低甘油、醋酸盐和丙酮酸盐的形成［17］。通过减少NADH并得到一个更易接受NAD+/NADH的比率，可进行glt-1基因的过度表达处理。另一项研究显示，酿酒酵母中glt-1基因的过度表达和fps1基因的消除，会使葡萄糖发酵产乙醇的量从108g/L提高到123g/L［18］。Hahn-Hagerdal等［19］已对戊糖发酵的酵母菌进行研究，并对木糖发酵的P.stipitis的基因组序列进行了测序［20］。采用P.stipitis对木糖进行间歇发酵可获得50g/L乙醇、0.35～0.44g/g的木糖和80％理论产量的发酵水解产物［21］。并且P.stipitis包含很多的编译密码，有内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、几丁质酶等。

3.2 革兰氏阴性菌

研究对E.coli和Klebsiella oxytoca进行重组DNA，将混合酸的生产转化成了乙醇的生产。通过克隆和表达K.oxytoca的乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶基因，重组菌株能够在真菌纤维素增加时高效率转化结晶纤维素成为乙醇［22］。其中100g/L的纤维素可得到乙醇的最大理论产量是81％～89％，乙醇滴定度高达47g/L。其它大肠杆菌的基因工程菌以60g/L生产乙醇［23］。并且通过代谢工程技术，乙醇的产量可以进一步增加。重组大肠杆菌可发酵玉米纤维水解产物得到35g/L乙醇［24］，所用时间为55h，每克有效糖产0.46g乙醇（以最高产率90％）。玉米纤维中70％是碳水化合物，由纤维素和半纤维素组成，对玉米纤维最好用烯酸进行预处理，这样就可避免抑制产物（如糠醛、来自木质素的5-羟甲基糠醛酸等）的生成，在发酵过程中加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，可使单糖产乙醇量的理论值高达85％～100％［25］。用氨水对玉米纤维进行前处理，再通过重组大肠杆菌进行发酵，可得乙醇产率为27g/L［26］。

3.3 对真菌纤维素酶的需求

以上讨论的酵母菌和革兰氏阴性菌发酵过程都需要添加真菌纤维素酶（纤维素二糖水解酶Ⅰ），此酶可由Trichoderma reesei制得，由此得到了同步糖化发酵（SSF）过程［27］。纤维素酶通常由发酵菌产得，而只有革兰氏阳性的厌氧过程（革兰氏阳性厌氧菌）不需要此酶。

T.reesei可以诱导纤维素生成纤维素酶，纤维素酶低构成水平是通过水解某些纤维素成为小的可溶性引诱物，然后再诱发形成高浓度的纤维素酶［28］。以往得到此酶的成本很高，但在过去几年中，由于杰能科国际公司和诺维信公司与能源部的拨款（共计3000万美元），研究者通过酶工程和发酵工程使T.reesei纤维素酶的成本降低超过10倍［29］。然而，酶的价格仍需进一步降低。

3.4 革兰氏阳性厌氧菌

目前，研究者正在研究用细菌（如梭状芽孢杆菌用）生产乙醇，它们之所以具有利益价值，是因为它们可以利用纤维素废物并生成乙醇，这是生物间罕见的效果。细菌的纤维素酶体系能调解含有木质素材料（如硬木树）的水解产物，人们可以先通过烯酸以及不包含木质素的培养基进行前处理。原则上，厌氧乙醇发酵的概念是非常简单的，即乙醇生产过程中一个单一发酵与五个生物学中间体反应：（1）纤维素酶和半纤维素酶的形成；（2）纤维素和半纤维素的水解；（3）糖和低聚糖的摄取；（4）己糖发酵；（5）戊糖发酵，所有反应均在一个单一的过程中发生。此厌氧工艺的优点是可以减少在生物降解酶反应容器中搅拌/通气的能量消耗。厌氧菌一般具有较低的细胞生长产量，因此，更多的培养基可被转化成乙醇，并且在原纤维素酶上生产比添加纤维素酶更加经济。除了嗜温性厌氧菌，嗜热性厌氧菌也被广泛用于乙醇的生产，原因如下：（1）酶生产、糖化和乙醇生产的单步性，从而消除了需要真菌酶的成本；（2）嗜热细菌有健全和稳定的酶控制；（3）在60℃高温下发酵可以产生较少有害污染影响；（4）在高温下生长有便于移走并重得挥发性产物（如乙醇）；（5）生长率高，对纤维素和半纤维素的代谢速度快；（6）低细胞生产量可以使更多的基质转化成乙醇；（7）在氧转化、发酵罐的搅拌和冷却上能量的消耗减少。嗜热厌氧菌（如Clostridium thermocellum）可使纤维素酶生产、糖化和发酵一体化，C.thermocellum可以直接将废物纤维素和结晶纤维素转化成乙醇［30］，其纤维素酶体系由许多酶复合物构成。C.thermocellum将纤维素分解成纤维素糊精和纤维二糖，这些产物可被细胞摄取并进一步利用，最终的产物是乙醇、乙酸、乳酸、氢和二氧化碳。这种微生物能最高效率的利用纤维素，并对结晶纤维素有着最高的生长速率。

由于梭状芽胞杆菌（如C.thermocellum）没有使戊糖（来自半纤维素）转化成乙醇的能力，混合培养的概念就诞生了。对嗜热厌氧菌进行混合培养，可使纤维素生物质转化乙醇的成本降低两倍。人们利用资源研究细菌组合，将农业、林业和城市资源转化为乙醇，成为石油资源的替代品，从而可以提高经济效益，这种现代技术称为"综合生物处理过程（CBP）"［15］，它可成为产乙醇商业化的重要手段。厌氧培养体系的优点有：消除了酶生产的资本和运营成本、大大降低了产酶培养基的转移、酶和发酵体系的兼容。共培养过程是先经过酸的温和前处理，再最大限度地水解和发酵木质纤维素/半纤维素生物质［30］。CBP过程包括：（1）采用C.thermocellum发酵生产纤维素酶和半纤维素酶；（2）水解纤维素为纤维低聚物和纤维二糖；（3）将半纤维素转化为阿拉伯木聚糖、木二糖、低聚木糖和戊糖；（4）低聚糖和葡萄糖的摄取；（5）C.thermocellum发酵己糖生成乙醇；（6）T.saccharolyticum.发酵戊糖生成乙醇。

在进行共培养时，采用纤维糊精磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶进行磷酸化切割，可从纤维素中摄取低聚糖和葡萄糖。相对于通过外因使纤维素水解为纤维二糖，用很多蜂窝状磷酸化酶的磷酸化切割更有效用，因为后者具有较低的Km值，因此纤维糊精比纤维二糖更容易被利用［31］。细胞新陈代谢的另一个关键点是在磷酸化过程中产生了正ATP平衡。

虽然共培养体系非常有前途，但还是存在一些不足：一是发酵产乙醇过程中的终产物抑制［32］，此弊端可通过将稀培养液中的乙醇蒸馏掉来抵消；另一点是由于副产物乳酸和醋酸的生成造成乙醇产量低。针对低乙醇产量有两种解决方法：一是消除新陈代谢的分支，此法需调查研究可能影响两个共培养生物体间基因转化的因素，但由于缺乏这些共培养物分子基因的信息，研究受到了阻碍；另一种是淘汰醋酸激酶和乳酸脱氢酶基因，它们负责分支代谢途径，进行此操作的一个先决条件是外源DNA插入细菌的能力，目前研究已取得了一些进展，可通过电转化和外源红霉素耐药特点的表达，使C.thermosaccharolyticum成功的转化［33］。

4 结论与展望

自20世纪70年代，人们一直处于一个动荡的能源时代。美国是由玉米生产乙醇，巴西由蔗糖生产乙醇。然而至少是在美国，人们先基本用完玉米再研究寻求新原料。首先人们利用农场和森林中的木质纤维素生物质来研究制备生物燃料，随后城市垃圾也作为制备生物燃料的原料。在未来，生物制品（生物乙醇、丁醇、生物柴油、其他的短链醇和生物碳氢化合物）的研究将越来越多，并且一本有关生物能源的新书提到，生物可利用物还包含沼气、生物甲醇、生物氢和微生物燃料电池等［2］。这些潜在的能源会增加我国的能源独立和国土安全，并减少温室气体排放以及避免一系列的环境问题，同时也会推动这动荡的经济达到平和。在微生物和遗传方面，对大部分微生物已做了很多基础工作，但在建立生产生物燃料的新工厂方面，仍需人们进一步努力，新反应过程需在兼顾效率与成本的情况下进行扩大化生产。很明显，生物燃料的未来非常光明。

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