杨 平， 顾淑娥， 张丽芳， 杜彦辉

三磷酸腺苷结合盒转运子(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)可以通过影响血脂水平、保护血管内皮、介入炎性反应参与动脉粥样硬化的过程，减轻动脉粥样硬化的程度［1］。ABCA1基因编码区和非编码区含有大量的SNP位点，研究表明这些SNP位点与血浆脂质水平以及动脉硬化程度有密切的相关性，而脑梗死患者大部分都伴有动脉粥样硬化。国内的研究对象大部分是不同区域的汉族人群，本研究探讨回、汉族在脑梗死患者ABCA1的R219K多态性的分布的差异及其与血脂的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

入选2008年1月～2010年5月宁夏医科大学附属医院神经内科收治的脑梗死住院患者266例，汉族患者(汉族脑梗死组)185例，平均年龄63.1±15.8岁，男性116例，女性69例;回族患者(回族脑梗死组)81例，平均年龄60.6±12.7岁，男性52例，女性29例。并登记患者的基本情况(既往史、BMI指数等)。脑梗死组患者入选标准:(1)脑梗死诊断符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准;(2)经头颅CT或MRI检查证实;(3)同意提供血标本;(4)患者或家属同意签署“知情同意书”。排除标准:(1)腔隙性脑梗死、脑出血、脑栓塞、蛛网膜下腔出血;(2)继发性脑血管病患者，如外伤、血液病、炎症等引起者;(3)静脉系统血栓形成;(4)恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者(5)不同意提供血标本;(6)患者或家属不同意签署“知情同意书”。

1.2 方法

1.2.1 血脂检测 收集回、汉族脑梗死患者空腹12h血标本5ml，室温2～3h后3000r/min离心10min，-20℃保存血清和血浆，测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，由我院检验科全自动生化仪检测。

1.2.2 R219K多态性检测 DNA提取采用AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒。基因型确定采用PCR-RFLP法，PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒由北京全式金生物技术有限公司生产，PCP引物由上海生工生物工程有限公司合成，R219K上游 引 物:5’-GCAAGGCTACCAGTTACATTTG ACAAG-3’;下游引物:5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGG-3’。50μl PCR 反应体系，其中DNA 模板 0.5 μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1 μl，2 × EasyTaq PCR Super Mix 25μl，ddH2O 22.5μl。R219K 扩增条件:首先 94℃预变性5min 后 94℃ 变性 1min、53℃ 退火 30s、72℃ 延伸40s，共32个循环;最后 72℃延伸 10min，4℃保存。用Primer 5.0检索的Eco130I作为R219K的限制性内切酶，酶切反应体系 20μl:PCR产物 10μl，Eco130I(Fermentas公司生产)1μl，10 × Eco130I缓冲液(含 BSA)2μl，ddH2O7μl。37℃酶切8h，65℃灭活20min，3%琼脂糖150V电压电泳30min。

1.3 统计学方法

遗传平衡检验用 HEW1.0软件，数据处理用SPSS 11.5统计学软件;基因型和等位基因频率的比较采用χ2检验或Fisher的确切概率法，多组之间率的比较采用χ2分割法，多态性位点对两组血脂水平的影响采用方差分析;P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组基本情况比较

两组间在年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒等方面无统计学差异，具有可比性(见表1)。

表1 各组基本情况的比较

2.2 ABCA1基因R219K酶切结果

Eco130I酶切后出现3种片段组合(见图1):RR为 166 bp;RK 为 166 bp、101 bp、65 bp;KK 为101bp、65 bp。

2.3 Hardy-Weinberg平衡

R219K在回、汉脑梗死组基因型的观察值与期望值检测符合Hardy-Weinberg平衡(见表2)。

2.4 两组ABCA1基因R219K多态基因型与等位基因频率的比较

见表3。两组等位基因频率无明显统计学差异(χ2=1.008，P=0.315);两组间基因型频率有统计学差异(χ2=7.647，P=0.022)，与 RK 型比较，回族脑梗死组KK基因型较较汉族脑梗死组低，差异有统计学意义(χ2=7.657，P=0.006);而将回、族脑梗死患者的性别、年龄(≥60岁)、高血压病、糖尿病进行亚组分析后结果显示，仅回族男性(χ2=6.725，P=0.010)和伴有高血压(χ2=7.127，P=0.008)的脑梗死患者KK型较汉族脑梗死组低，而年龄和糖尿病在两组组间无明显统计学差异(P＞0.05)。

2.5 3种基因型与血脂的关系

见表4。RR型TG、TC较高，而HDL-C较低，KK型HDL-C较高，但均无统计学差异(P＞0.05)。

图1 ABCA1的PCR产物酶切电泳结果

表2 两组Hardy-Weinberg平衡性检验

表3 两组ABCA1基因R219K多态基因型与等位基因频率的比较

表4 ABCA1基因的R219K多态各基因型间血脂水平的比较(mmol/L)

3 讨论

ABCA1基因位于常染色体9q31上，约150kb，包含50个外显子和49个内含子，转录起点上游1453kb是启动子区，有多个调节脂质代谢的转录因子结合位点。它所编码的蛋白称为ABCA1蛋白，是一种跨膜糖蛋白，其相对分子质量为2.2×105，含有2261个氨基酸，在结构上ABCA1由ABC转运体被确定为在ATP结合域的存在基础上而发挥作用，其中含有3个具有特征性的保守区域［2］。ABCA1基因至少50个突变已被确认。其中包括23个错义突变，6个无义突变，21个插入或缺失。49个突变发生在外显子，所有的突变都可能导致细胞内脂质的流出降低［3］。R219K多态性作为被公认为是抗动脉粥样硬化的多态，与HDL-C增高，甘油三酯水平的降低有关［4］。ABCA1基因突变可导致Tangier病(TD)和家族性低α脂蛋白血症(FHA)，临床表现为严重的HDL、apoA1低下、早发动脉粥样硬化、伴有肝脾肿大和外周神经病变等［5］。由于ABCA1促进细胞内的TC和磷脂转运至HDL-C前体载脂蛋白A1，因此该蛋白在逆转运过程中起第一步限速作用，启动胆固醇逆转运过程，防止早期动脉硬化［6］。

R219K多态为第7号外显子 ABCA1基因第1051位核苷酸发生G碱基替换成A碱基，导致精氨酸(Arg)-赖氨酸(Lys)替代。该多态与冠心病关系密切，研究也较多。Clee等［7］研究表明携带K等位基因者患冠心病的风险降低，K等位基因是动脉粥样硬化的独立保护因素，首次发现R219K有减少冠心病事件及冠状动脉病变程度的作用。国外有研究表明［8］，不同人种ABCA1基因 R219K等位基因变异频率不同，美国黑人(59.5%)明显高于白人(26.2%)，KK+RK 携带者，黑人为 83.3%，而白人为44.2%。可能R219K基因型的表达受遗传、环境因素等影响，不同种族之间存在差异。在伊朗人群中，RR型增加患冠心病的风险，且是冠心病的独立危险因素［9］。最近的一项Meta分析研究也显示携带等位基因K患冠心病风险显著降低，K等位基因在亚洲人和高加索人中都是冠心病的保护因素。KK型较RR型的HDL-C水平高，但按种族分组分析后仅仅是在亚洲人KK型与高水平HDL-C相关［10］。

国内外研究关于ABCA1与脑梗死的关系很少报道，关于R219K多态性与脑梗死和血脂水平的关系目前还存在争议，Andrikovics等［11］报道在匈牙利脑卒中人群中K等位基因具有保护作用，在小于50岁的卒中患者中K等位基因也明显减少，R219K与脑梗死有关且独立于HDL-C等血脂水平的改变。国内研究也认为［12］汉族脑梗死患者与健康对照组之间基因分布不同，汉族脑梗死患者中KK型更少，而RR型较多。KK型可能降低脑梗死的风险，特别是在男性、年龄大于65岁、高血压的患者中，K等位基因可能是脑梗死的保护因素。有研究显示［13］在688例健康人群中，R219K变异与血脂水平无关，但在无吸烟史的健康者中，K等位基因显现出了降低颈动脉中层内膜厚度和减少斑块进展的能力，这可能是和K等位基因与减少脑梗死的风险有一定的联系。而Pasdar研究［14］表明在英国人群中R219K多态与缺血性卒中无明显相关性，但KK基因型者LDL-C水平更高，TG水平更低。我们的既往研究中也表明汉族脑梗死患者与ABCA1 R219K不相关，但ABCA1基因的R219K多态RR型可能是男性患脑梗死的易感基因［15］。本研究结果表明R219K位点3种基因型在人群中分布不均衡，RK基因型最多见，RR、KK基因型较少见，等位基因频率在各组间无明显差别，而回族脑梗死患者KK基因型明显较低，但分层分析后显示只发生在回族男性和伴有高血压的患者中。

脑梗死患者R219K多态与血脂的关系研究较少，国内一项研究表明［16］RR、RK和KK 3种基因型中，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平依次呈上升趋势，ABCA1 R219K变异可影响血脂水平，携带者(RK+KK型)对血脂有益，以男性人群为主，这种作用在≤70岁人群尤其明显。但我们的研究显示R219多态RR型的TG水平较高，而HDL-C水平较低，但均无统计学差异，各基因型之间血脂水平无明显差异，R219K对回、汉脑梗死患者的作用可能与血脂水平无关。总之，回、汉族脑梗死患者ABCA1基因的R219K多态性可能存在差异，回族脑梗死患者KK基因型较汉族低，但仅仅是发生回族男性和高血压患者中，且其发生机制可能与血脂水平无关。

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